Nanopore Read Until의 진화 – UNCALLED 논문 리뷰

Targeted nanopore sequencing by real-time mapping of raw electrical signal with UNCALLED

UNCALLED란 무엇인가?

Oxford Nanopore Adaptive Sampling을 가능하게 만든 핵심 기술

 

Oxford Nanopore sequencing의 가장 혁신적인 기능 중 하나는 바로 원하는 DNA만 실시간으로 선택해서 시퀀싱할 수 있는 “Adaptive Sampling” 기술입니다. 최근에는 MinKNOW에서 비교적 익숙한 기능이 되었지만, 사실 이 기술이 가능해지기까지는 여러 중요한 연구들이 있었습니다.

 

이번에 소개할 논문은 그중에서도 매우 중요한 논문 중 하나인 UNCALLED 연구입니다. 논문 제목은 “Targeted nanopore sequencing by real-time mapping of raw electrical signal with UNCALLED”이며, 2021년 Nature Biotechnology에 발표되었습니다. 이 논문은 기존 Read Until 기술의 가장 큰 한계를 해결하면서, 오늘날 Adaptive Sampling의 실질적인 기반을 만든 연구라고 볼 수 있습니다.

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기존 Nanopore Read Until 기술의 가장 큰 문제는 속도였습니다.

Nanopore sequencing은 DNA가 nanopore를 통과할 때 발생하는 전류(current) 변화를 실시간으로 측정합니다. 문제는 이 신호를 분석해서 현재 읽고 있는 DNA가 어떤 유전체 영역인지 빠르게 판단해야 한다는 점입니다.

 

기존 방법은 크게 두 가지였습니다.

첫 번째는 DTW(Dynamic Time Warping)를 이용해 raw signal 자체를 reference와 직접 비교하는 방식입니다. 하지만 이 방법은 계산량이 너무 많아서 작은 genome에서는 가능했지만 human genome처럼 큰 reference에는 현실적으로 적용이 어려웠습니다.

 

두 번째는 먼저 basecalling을 수행한 뒤 alignment를 하는 방식입니다. 하지만 GPU가 필요할 정도로 계산량이 크고, 충분한 signal이 쌓일 때까지 기다려야 하기 때문에 eject 타이밍이 늦어지는 문제가 있었습니다.

 

연구진은 이 문제를 해결하기 위해 “UNCALLED”라는 새로운 알고리즘을 개발했습니다.

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UNCALLED의 핵심 아이디어는 매우 흥미롭습니다.

일반적인 방식처럼 먼저 basecalling을 하지 않고, raw electrical signal 상태에서 바로 reference genome에 mapping을 수행합니다.

 

즉:

Raw signal → 바로 mapping

이라는 개념입니다.

 

이를 위해 연구진은 FM-index 기반 알고리즘을 사용했습니다. 이는 BWA나 Bowtie 같은 aligner에서 사용하는 매우 빠른 문자열 검색 알고리즘입니다.

과정을 간단히 정리하면:

1. Nanopore current signal 수집
2. Signal을 event로 변환
3. 각 event가 어떤 k-mer일 확률 계산
4. FM-index를 사용해 reference genome 검색
5. 실시간으로 위치 결정
6. Target이 아니면 eject

라는 흐름입니다.

기존 Read Until과 가장 큰 차이는 “속도”였습니다.

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연구진은 먼저 E. coli 데이터를 사용해 성능을 테스트했습니다.

놀랍게도 대부분의 read를 sequencing 시작 후 1초 이내에 mapping할 수 있었습니다.

당시 MinION sequencing speed가 약 450 bp/sec였다는 점을 고려하면, 매우 빠른 속도였습니다.

논문에서는:

• 대부분의 read가 50ms 이내 mapping
• single CPU core에서도 동작
• 93.7% mapping accuracy

를 보여주었습니다.

즉, GPU basecalling 없이도 실시간 selective sequencing이 가능하다는 것을 입증한 것입니다.

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이후 연구진은 실제 metagenomics 환경에서 매우 흥미로운 실험을 수행했습니다.

Zymo mock microbial community를 이용해 bacterial genome을 depletion하고, yeast genome을 enrichment하는 실험입니다.

쉽게 말하면:

원하지 않는 bacterial DNA는 eject하고,
남은 yeast DNA만 더 많이 읽도록 만든 것입니다.

결과는 상당히 인상적이었습니다.

• bacterial read의 90~96% 제거
• yeast enrichment 최대 4.46배 증가

를 달성했습니다.

논문 Figure 2를 보면 실제로 yeast coverage가 크게 증가한 것을 확인할 수 있습니다.

이 실험은 오늘날 adaptive sampling host depletion의 원형이라고 볼 수 있습니다.

현재 metagenomics에서 흔히 사용하는:

• human depletion
• host depletion
• pathogen enrichment

같은 개념이 이미 이 논문에서 구현된 것입니다.

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하지만 이 논문의 진짜 하이라이트는 인간 유전자 패널 실험입니다.

연구진은 hereditary cancer와 관련된 148개 유전자를 target으로 설정했습니다.

그리고 GM12878 샘플에서:

• target gene만 enrichment
• 나머지 genome은 eject

하는 adaptive sequencing을 수행했습니다.

결과는 상당히 놀라웠습니다.

• Control flowcell: 5.4x coverage
• UNCALLED: 29.6x coverage

즉 약 5.5배 enrichment를 달성했습니다.

Figure3의 control 대비 UNCALLED의 coverage distribution이 완전히 달라진 것을 볼 수 있습니다.

특히 중요한 점은 단순 coverage 증가가 아니라:

• SNP detection
• Indel detection
• Structural Variant detection
• Methylation analysis

까지 모두 가능했다는 것입니다.

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이 논문이 정말 중요한 이유는 바로 structural variant(SV) 분석입니다.

기존 short-read sequencing에서는 repetitive region이나 mobile element insertion 분석이 매우 어렵습니다.

하지만 UNCALLED enrichment를 이용한 long-read sequencing은:

• ONT WGS
• PacBio HiFi

와 거의 동일한 수준의 SV concordance를 보여주었습니다.

특히 논문에서는 MUTYH gene exon 내부의 Alu insertion을 검출하는 장면이 매우 인상적입니다.

Figure 4를 보면:

• ONT
• PacBio

에서는 insertion이 보이지만,

Illumina에서는 검출되지 않습니다.

이는 short-read가 repetitive Alu insertion 전체를 spanning하지 못하기 때문입니다.

이 결과는 왜 long-read sequencing이 임상 유전체 분석에서 중요한지를 매우 잘 보여줍니다.

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또 하나 매우 흥미로운 부분은 methylation 분석입니다.

Nanopore sequencing은 PCR amplification 없이 native DNA를 직접 읽기 때문에 methylation signal을 유지할 수 있습니다.

연구진은 UNCALLED enrichment 데이터에서 promoter methylation 분석도 수행했습니다.

결과적으로:

• Whole genome ONT methylation
• WGBS

와 매우 높은 상관관계를 보여주었습니다.

Figure 5를 보면 promoter methylation correlation이 상당히 높게 나타납니다.

즉 targeted adaptive sequencing만으로도 methylation 연구가 가능하다는 것을 의미합니다.

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이 논문은 단순한 알고리즘 논문이 아닙니다.

현재 Oxford Nanopore의:

• Adaptive Sampling
• Host depletion
• Target enrichment
• Real-time selective sequencing

기술의 실질적인 foundation 역할을 한 논문입니다.

특히 중요한 점은: “Basecalling 없이 raw signal 단계에서 판단한다” 라는 새로운 개념을 제시했다는 점입니다.

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오늘날 Adaptive Sampling은:

• Dorado
• GPU acceleration
• minimap2
• faster Read Until API

등으로 훨씬 발전했지만, “실시간 raw signal 기반 selective sequencing” 이라는 핵심 개념은 바로 이 UNCALLED 논문에서 확립되었다고 볼 수 있습니다.

https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC8567335/