Direct RNA nanopore sequencing으로 본 인간 RNA modification

Direct RNA nanopore sequencing으로 본 인간 RNA modification

https://www.youtube.com/watch?v=WmhpcO4XEw8

 

RNA에는 염기서열 정보 외에도 chemical modification(RNA modification) 이 존재하며, 이는 전사체의 기능과 운명을 결정하는 중요한 정보다. 현재까지 알려진 RNA modification은 170종 이상으로, m6A, m5C, pseudouridine(Ψ) 등이 대표적이다. 이들 modification은 번역, RNA 안정성, 분해, splicing 등 RNA 생애 전반에 관여하며, 암·희귀질환 등 다양한 질병과 직접적으로 연결되어 있다. 하지만 기존 RNA-seq은 cDNA 변환 과정에서 이러한 정보를 잃어버린다는 한계가 있다. 이 글에서는 Direct RNA nanopore sequencing을 이용해 인간 전사체 전반의 RNA modification을 탐색한 연구를 정리한다.

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RNA modification이란?

RNA modification은 canonical 염기에 화학기가 추가되거나 구조가 변형된 상태를 의미한다.

• 예시: m6A, m5C, inosine, pseudouridine(Ψ)
• 위치: RNA 내부 또는 5’/3’ 말단
• 기능:
  • 번역 조절
  • RNA 안정성 및 분해
  • 전사 및 splicing 조절

RNA modification 패턴이 깨질 경우 암을 포함한 다양한 질환이 발생할 수 있다.

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기존 분석 방법의 한계

기존 RNA modification 분석은 다음과 같은 방식에 의존했다.

• Mass spectrometry
• 항체 기반 pull-down (예: MeRIP-seq)
• 특정 modification에 특화된 화학 반응

한 실험 = 한 modification 이라는 구조적 한계

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Direct RNA nanopore sequencing의 핵심 장점

Nanopore 기반 Direct RNA sequencing(DRS)은 RNA를 cDNA로 변환하지 않고 native RNA 그대로 읽는다.

• RNA modification이 nanopore를 통과할 때 → ionic current signal 변화 발생
• 이 신호 차이를 통해 modification을 직접 탐지 가능

이 연구에서는 NanoCompore라는 분석 도구를 사용했다.

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연구 전략: IVT(reference) 기반 비교

이 연구의 핵심 아이디어는 다음과 같다.

1. 동일한 세포에서 두 종류의 RNA 생성

• Native RNA (modification 유지)
• In vitro transcription(IVT) RNA (modification 제거)

2. 두 샘플을 Direct RNA sequencing으로 비교

• 동일한 전사체
• modification 유무만 다른 상태

특정 writer enzyme knockout 없이도 여러 modification을 동시에 탐색 가능

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실험 개요

• 세포주: K562 (백혈병 세포주)
• 플랫폼: PromethION (RNA002 chemistry)
• 데이터 규모:
  • Native RNA: ~9M reads
  • IVT RNA: ~3–5M reads

분석 결과:

• 약 2.9M 위치 분석
• 26,000개 modification site
• 2,500 transcripts / 1,700 genes

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전사체 전반에서의 modification 분포

• NanoCompore로 검출된 site는
  • 기존 annotation(m6A 포함)과 전반적으로 잘 겹침
  • 특히 coding region에서 더 많은 site 검출

→ 아직 annotation되지 않은 modification이 다수 존재함을 시사

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Motif 분석: m6A와 m5C 신호 확인

k-mer motif 분석 결과:

• DRACH motif (대표적 m6A writer motif) 다수 검출
• m5C와 연관된 motif도 동시에 풍부하게 검출

Direct RNA sequencing 신호에 m6A + m5C 정보가 함께 반영됨을 의미

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사례 분석: BCR 유전자

K562 세포의 대표적인 암 관련 유전자 BCR 분석 결과:

• m6A annotation과 NanoCompore site가 잘 일치
• 일부 m6A site 인접 위치에서 m5C motif 동시 검출

→ m6A와 m5C가 공간적으로, 기능적으로 연결되어 있을 가능성 제시

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Single-molecule 수준에서 본 modification coordination

Direct RNA sequencing의 강점은 single-molecule 정보에 있다.

KRTCAP2 유전자 분석

• 서로 인접한 m6A–m5C site 조합 존재
• 같은 RNA 분자에서:
  • 두 modification이 함께 존재하는 경우는 기대치보다 많음
  • 반대로 하나만 존재하는 경우는 기대치보다 적음

일부 RNA modification은 무작위가 아니라 coordinated deposition 가능성

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연구의 의미와 한계

의미

• IVT reference 전략으로
  • 여러 RNA modification을 동시에 탐지 가능
  • writer knockout 없이 전사체 전체 분석
• Direct RNA sequencing의 분석 잠재력 입증

한계

• signal만으로 modification 종류를 완전히 구분하기는 어려움
• orthogonal validation (MS, chemistry-based assay) 필요

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마무리

이 연구는 Direct RNA nanopore sequencing이 단순한 RNA-seq 기술을 넘어,

• 인간 epitranscriptome을 직접 관찰하는 도구
• single-molecule 수준에서 RNA modification의 패턴과 상호작용을 분석할 수 있는 플랫폼임을 보여준다.

앞으로 RNA004 chemistry, Dorado 기반 modification calling과 결합될 경우, 이 접근법은 암·희귀질환·RNA 치료제 연구에서 더욱 강력한 분석 도구가 될 것이다.

https://nanoporetech.com/resource-centre/a-survey-of-rna-modifications-across-the-human-transcriptome-by-direct-rna-nanopore-sequencing