Nanopore에서 SSP가 무엇인지, 왜 필요한지, 그리고 대안은 무엇인지 쉽게 정리해보기

Nanopore로 cDNA 실험을 하다 보면 SSP(Strand-Switching Primer)라는 용어를 자주 보게 됩니다. 처음 접하면 조금 어렵게 느껴지지만, 사실 원리는 생각보다 단순합니다. 이 글에서는 SSP가 무엇이고 왜 필요한지, 그리고 SSP의 한계와 대체 방법까지 초보자도 이해하기 쉬운 방식으로 정리해보겠습니다.

cDNA-PCR Sequencing V14

 

먼저 SSP는 Strand-Switching Primer의 줄임말입니다. 이름만 보면 복잡해 보이지만, 쉽게 말하면 RNA의 맨 앞부분인 5’ 끝까지 포함된 완전한 cDNA를 만들기 위해 붙여주는 프라이머입니다. 보통 RT 효소는 RNA를 읽다가 중간에 멈추거나 떨어지는 일이 흔합니다. 그래서 RNA 전체를 끝까지 완전히 복제하지 못하는 경우가 많습니다. SSP는 이 문제를 보완하기 위해 만들어진 장치라고 이해하면 됩니다.

 

SSP의 동작 원리는 비교적 간단합니다. RT 효소가 RNA의 5’ 끝에 도달하면 아주 짧은 서열을 붙이는데, 이때 SSP가 그 서열에 결합합니다. 이 결합을 통해 cDNA의 5’ 끝에 어댑터가 자동으로 형성되고, 이후 PCR이나 시퀀싱 과정에서 이 어댑터를 통해 전사체 전체를 일정한 방식으로 증폭하고 읽을 수 있게 됩니다. 즉 SSP는 완전한 형태의 cDNA를 만들고 전사체 전체를 균일하게 분석할 수 있도록 도와주는 핵심 요소입니다.

 

하지만 SSP가 항상 좋은 것만은 아닙니다. 가장 큰 문제는 특정 유전자를 선택적으로 증폭하고 싶을 때 선택성이 거의 없어지는 점입니다. SSP가 붙는 순간 모든 RNA가 비슷한 구조를 가지게 되기 때문에, PCR 단계에서는 특정 유전자가 아니라 전체 RNA가 함께 증폭됩니다. 따라서 타깃 유전자의 비율이 크게 낮아지거나 오프타깃 신호가 많이 섞이는 문제가 생길 수 있습니다. 또한 SSP 구조는 어댑터끼리 붙어버리는 현상이 생기기도 하여 짧은 비특이적 산물이 다량 만들어지는 단점도 있습니다. 이런 이유로 SSP는 전사체 전체를 넓게 탐색하는 데는 매우 유리하지만, 특정 유전자를 정확하게 보고 싶은 실험에는 적합하지 않습니다.

 

그렇다면 SSP 없이도 full-length에 가까운 RNA 정보를 얻을 수 있는 방법은 무엇이 있을까요. 몇 가지 중요한 대안이 있습니다.

 

첫 번째 대안은 Direct RNA Sequencing입니다. 이 방식은 cDNA를 만들지 않고 RNA 자체를 직접 읽는 방법입니다. SSP도 필요 없고 RT 효소가 완전한 cDNA를 만들지 못하는 문제도 피해갈 수 있습니다. 읽기 방향이 polyA에서 시작하여 5’으로 이동하는 구조이기 때문에 아주 긴 RNA에서는 5’ 신호가 약해질 수 있지만, 스플라이싱, 아이소폼, 유전자 융합 등 전사체 구조 분석에는 가장 강력한 방법입니다.

 

두 번째는 5’ cap에 어댑터를 직접 붙여 full-length mRNA만 선택하는 방식입니다. RNA의 5’에 있는 cap 구조는 정상적인 mRNA만 가지고 있기 때문에, cap에 어댑터를 붙이면 진짜 full-length 전사체만 선택적으로 모을 수 있습니다. SSP 없이도 완전한 mRNA를 잡을 수 있는 가장 정교한 접근입니다.

 

세 번째는 5’ RACE 방식입니다. 특정 유전자를 full-length로 보고 싶을 때 사용하는 기술입니다. RNA의 5’ 끝에 어댑터를 붙이고 3’ 쪽에는 유전자를 위한 프라이머를 사용해 역전사를 진행한 뒤, 어댑터 프라이머와 유전자 특이 프라이머로 PCR을 수행합니다. 이 방식은 특정 유전자 full-length를 매우 높은 효율로 확보할 수 있어 타깃형 분석에 적합합니다.

 

마지막으로 random priming 후 양쪽에 어댑터를 붙이는 방식도 있습니다. 이 경우 full-length를 보장해 주는 장치는 없지만 RNA 품질이 좋고 RT 효율이 높을수록 자연스럽게 긴 cDNA가 많이 생성되는 구조입니다. SSP 없이도 비교적 긴 읽기를 확보할 수 있지만, 안정적인 full-length 확보 면에서는 위의 방법들보다 다소 제한적입니다.

 

정리하자면 SSP는 전사체 전체를 균일하게 풀길이로 확보하기 위한 핵심 기술이지만, 특정 유전자에 집중한 타깃 실험에는 적합하지 않은 방식입니다. 실험 목적에 따라 가장 적합한 전략이 달라지며, 전사체 전체를 보고 싶다면 SSP 기반 cDNA-PCR이나 direct cDNA가 더 나을 수 있고, 특정 유전자를 정확하고 깊게 보고 싶다면 5’ RACE가 좋은 선택입니다. RNA 본래의 구조나 아이소폼을 자연스럽게 관찰하고 싶다면 Direct RNA Sequencing이 강력한 옵션입니다.

 

Nanopore 실험은 목적에 따라 전략을 적절히 선택하는 것이 매우 중요합니다. SSP의 역할과 한계, 그리고 이를 대신할 수 있는 다양한 방법을 이해해두면 실험 디자인을 훨씬 더 정확하고 유연하게 구성할 수 있을 것입니다.