A guide to long-range PCR for Nanopore sequencing V.2

Nanopore Long-read Amplicon을 위한 Long-range PCR 프로토콜 정리

참고: protocols.io (LSK114 기반 Long-range PCR)

 

1. 프로토콜 개요

이 프로토콜은 다음 목적을 위한 것입니다.

• 특정 유전자(target gene)의 전체 CDS 증폭
• 다양한 RNA isoform을 최대한 포함
• Nanopore long-read sequencing용 amplicon 생성

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핵심 특징

• Amplicon 길이: 약 1 ~ 11 kb
• 높은 specificity (off-target 최소화)
• Multiplex sequencing 가능

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2. 실험 시작 전 (매우 중요)

RNA 품질 확인

• RIN > 7 이상 권장
• degradation 최소화 필수

이유: long PCR은 template 품질에 매우 민감함

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3. Primer 설계 과정

Step 1. Target CDS 확보

• UCSC Genome Browser에서 CDS 추출

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Step 2. Primer 설계

• Primer3Plus 사용

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Step 3. Primer 검증

• specificity 확인
• off-target 여부 확인

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추가 요소

• ONT Universal Primer (UP) 사용
  → 이후 barcoding을 위한 adapter 역할

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4. 실험 전략 (핵심 구조)

이 프로토콜은 2-step PCR 방식입니다.

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왜 2-step PCR을 사용하는가

1차 PCR:

• target gene만 증폭

2차 PCR:

• ONT primer를 붙여 sequencing 준비

장점:

• specificity 증가
• library prep 효율 증가

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5. 실험 단계 (핵심)

Step 1. 1차 PCR (Target amplification)

조건

• 반응 volume: 20 µL
• cycle: 5 cycles
• 온도: 72°C
• extension: 5분 30초

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특징

• ONT primer 없음
• 순수 target만 증폭

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사용 효소

• Platinum SuperFi II PCR Master Mix

long PCR용 high-fidelity enzyme

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Step 2. 1차 PCR 정제

• AMPure XP beads 사용
• bead 비율: 0.45X
• 최종 elution: 8 µL

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목적

• primer 제거
• 비특이적 산물 제거

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Step 3. 2차 PCR (ONT primer 부착)

조건

• 반응 volume: 20 µL
• cycle: 20 cycles
• 온도: 72°C
• extension: 5분 30초

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특징

• ONT Universal Primer 포함
• sequencing adapter 역할

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이 단계에서 Nanopore sequencing 가능한 구조 완성

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Step 4. PCR 결과 확인

방법

• Gel electrophoresis
• 또는 TapeStation

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조건

• gel: 1.5%
• voltage: 90V
• 시간: 약 70분

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확인 포인트

• 예상 크기 (1~11 kb)
• single band 여부

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Step 5. 최종 정제 및 준비

• clean-up 완료된 amplicon 사용
• 이후 ONT barcoding 진행

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Step 6. Nanopore Library Preparation

• LSK114 protocol 사용
• multiplex sequencing 가능

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6. 핵심 실험 포인트 정리

1) 2-step PCR이 핵심

• specificity 확보
• ONT adapter 효율적으로 부착

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2) Extension time이 매우 중요

• 5분 30초 사용
  → 약 5~10 kb target 대응

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3) Bead ratio (0.45X)

• 작은 fragment 제거
• long amplicon 유지

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4) Cycle 수 조절

• 1차: 5 cycles
• 2차: 20 cycles

이유

• error 최소화
• amplification 균형 유지

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7. 이 프로토콜의 장점

• 긴 유전자 구조 분석 가능
• isoform 다양성 확보
• Nanopore long-read에 최적화

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8. 실무에서 중요한 포인트

이 프로토콜의 성공은 다음 3가지에 달려 있습니다:

1. Primer 설계
2. RNA/DNA 품질
3. PCR 조건 최적화

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9. 언제 이 방법을 써야 할까

다음과 같은 경우에 적합합니다:

• full-length transcript 분석
• isoform 분석
• structural variant 확인
• long gene sequencing

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10. 핵심 요약

이 프로토콜은 2-step long-range PCR을 통해 1~11 kb 크기의 유전자 영역을 정확하게 증폭하고, 이를 Nanopore long-read sequencing에 바로 적용할 수 있도록 설계된 실험 방법이다.

https://www.protocols.io/view/a-guide-to-long-range-pcr-for-nanopore-sequencing-n2bvj9rdxlk5/v2