[Virus 농축] 폐수 바이러스 분석, 어떤 방법이 가장 좋을까? Nanopore 기반 농축 방법 비교

The Impact of Viral Concentration Method on Quantification and Long Amplicon Nanopore Sequencing of SARS-CoV-2 and Noroviruses in Wastewater

폐수 바이러스 농축 방법 비교 연구

(SARS-CoV-2 & 노로바이러스 + Nanopore 시퀀싱)

 

1. 연구 개요

이 연구는 폐수에서 바이러스를 분석할 때 중요한 단계인 

“바이러스 농축 방법(concentration method)”이

• 바이러스 정량 (qPCR)
• PCR 억제(inhibition)
• Nanopore 시퀀싱 결과

에 어떤 영향을 미치는지 비교한 연구입니다.

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2. 연구 목적

다음 3가지를 비교 분석:

1. RT-qPCR 억제 영향
2. 바이러스 정량 정확도
3. Nanopore 기반 시퀀싱 성능

특히

• SARS-CoV-2
• 노로바이러스 (GI, GII)

를 중심으로 분석 하였습니다.

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3. 비교한 농축 방법

총 4가지 방법:

• AS (Ammonium sulphate 침전)
• PEG 침전
• IP (InnovaPrep, 필터 기반)
• VS (Vivaspin, ultra filtration)

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4. 주요 결과

1) RT-qPCR 억제

• PEG: 억제 가장 심함 (~50%)
• AS: 중간
• VS, IP: 매우 낮음 (~2~3%)

결론
Ultra filtration(VS, IP)이 PCR 억제를 크게 줄임

이 그림은 서로 다른 바이러스 농축 방법(AS, IP, VS, PEG)을 사용했을 때 SARS-CoV-2 N1 RT-qPCR 분석에서 발생하는 PCR 억제 정도를 비교한 것이다. 결과는 농축 방법에 따라 억제 수준이 다르게 나타났으며, 같은 문자로 표시된 그룹 간에는 통계적으로 유의한 차이가 없는 것을 의미한다.

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2) 바이러스 정량 결과

• VS가 모든 바이러스에서 가장 높은 농도 측정
• AS는 가장 낮은 값

최대 차이:

• 최대 83배 차이 발생

의미
농축 방법에 따라 결과가 크게 달라짐

이 그림은 서로 다른 바이러스 농축 방법(AS, IP, PEG, VS)을 사용했을 때 폐수에서 검출된 SARS-CoV-2, crAssphage, phi6, 노로바이러스(GI, GII)의 농도를 비교한 것이다. 각 그래프는 바이러스 종류별 농도 차이를 보여주며, 같은 문자로 표시된 그룹 간에는 통계적으로 유의한 차이가 없음을 의미한다.

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3) 검출 민감도

• SARS-CoV-2 검출률:
  • AS: 84.7%
  • PEG: 90.6%
  • IP: 99.6%
  • VS: 97.0%

→ IP, VS가 가장 민감

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4) 노로바이러스 Nanopore 시퀀싱

• GI 타입:
  • VS가 가장 좋은 성능
• GII 타입:
  • IP가 약간 더 우수

→ 전체적으로:

• 더 많은 genotype 탐지 가능
• VS가 전반적으로 안정적

이 그림은 서로 다른 바이러스 농축 방법(AS, IP, VS)을 사용했을 때 노로바이러스의 long amplicon Nanopore 시퀀싱 결과를 비교한 것이다. 분석 항목은 read 품질, read 수, trimming 및 정렬된 read 수, 그리고 검출된 유전자형 다양성(taxa richness)을 포함한다. 또한, 회색 점은 개별 값, 검은 점은 평균값을 나타내며, 같은 문자로 표시된 그룹 간에는 통계적으로 유의한 차이가 없음을 의미한다.

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5) SARS-CoV-2 전체 유전체 시퀀싱

• VS만 높은 coverage 확보
• AS, IP는 낮은 read depth

핵심
→ Nanopore sequencing에서도 VS가 가장 우수

이 그림은 SARS-CoV-2 long amplicon 시퀀싱에서 29개 amplicon 구간별 read depth를 보여주며, 서로 다른 바이러스 농축 방법(AS, IP, VS)에 따른 차이를 비교한 것이다. 색상은 read depth를 의미하며, 검정은 read 없음, 회색은 낮은 read(<10), 노랑~빨강은 높은 read depth(≥10)를 나타낸다.	이 그림은 서로 다른 바이러스 농축 방법(AS, IP, VS)을 사용했을 때 SARS-CoV-2 long amplicon 시퀀싱 결과를 비교한 것이다. 분석 항목에는 read 품질, 총 read 수, 필터링된 read 수, reference에 정렬된 read 수, amplicon별 평균 read depth, 그리고 전체 유전체 coverage가 포함된다. 동일한 문자로 표시된 그룹 간에는 통계적으로 유의한 차이가 없음을 의미한다.
이 그림은 SARS-CoV-2 long amplicon 시퀀싱에서 29개 amplicon 구간별 read depth를 보여주며, 서로 다른 바이러스 농축 방법(AS, IP, VS)에 따른 차이를 비교한 것이다. 색상은 read depth를 의미하며, 검정은 read 없음, 회색은 낮은 read(<10), 노랑~빨강은 높은 read depth(≥10)를 나타낸다.	이 그림은 서로 다른 바이러스 농축 방법(AS, IP, VS)을 사용했을 때 SARS-CoV-2 long amplicon 시퀀싱 결과를 비교한 것이다. 분석 항목에는 read 품질, 총 read 수, 필터링된 read 수, reference에 정렬된 read 수, amplicon별 평균 read depth, 그리고 전체 유전체 coverage가 포함된다. 동일한 문자로 표시된 그룹 간에는 통계적으로 유의한 차이가 없음을 의미한다.

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5. 핵심 결론

→ 모든 결과 종합:

• VS (ultra filtration)가 가장 성능 좋음
• PCR 억제 ↓
• 정량 정확도 ↑
• 시퀀싱 품질 ↑

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한 줄 정리
→ “폐수 바이러스 분석에서는 농축 방법 선택이 결과를 크게 좌우하며, Vivaspin 기반 ultra filtration이 가장 효과적이다.”

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6. 실험 방법

6.1 샘플 수집

• 영국 폐수 샘플 240개
• 2021년 10~11월 수집

6.2 전처리

1. 원심분리 (10,000×g, 30분)
2. 상등액 사용
3. process control virus (phi6) 첨가

6.3 바이러스 농축 방법

1) AS (암모늄 설페이트)

• 150 mL 샘플 + ammonium sulphate
• 침전 후 pellet 사용

2) PEG

• PEG + NaCl 첨가
• overnight incubation
• 원심분리 후 pellet

3) IP (InnovaPrep)

• 필터 기반 농축
• Tween 20 첨가 후 처리

4) VS (Vivaspin)

• 원심 필터 방식 (10 kDa)
• 15 mL → 0.5 mL로 농축

6.4 핵산 추출

• NucliSENS 시스템 사용
• 자동 추출 (KingFisher)

6.5 qPCR / RT-qPCR

• 대상:
  • SARS-CoV-2
  • Norovirus GI, GII
  • crAssphage
  • phi6
• inhibition 측정:
  • external RNA control 사용

6.6 Nanopore 시퀀싱

Norovirus

• long amplicon (~1000 bp)
• dual typing (VP1 + RdRp)

SARS-CoV-2

• 1200 bp tiled amplicon
• whole genome sequencing

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분석 과정

1. basecalling
2. trimming
3. alignment (Minimap2)
4. coverage 계산

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7. 연구의 의미

이 논문이 중요한 이유:

1. 방법 선택이 결과를 바꿈

• 최대 80배 이상 차이

2. PCR inhibition 문제 해결 중요

• 환경 샘플에서 필수 요소

3. Nanopore 결과에도 영향

• 단순 정량뿐 아니라
  → 유전자 분석 품질까지 좌우

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8. 한줄 요약

“폐수에서 바이러스를 분석할 때는 농축 방법이 결과의 정확도를 결정하며, 특히 ultra filtration 방식이 가장 우수한 성능을 보인다.”

https://www.mdpi.com/2076-2607/13/2/229