[Virus] Nanopore 기반 병원체 검출: SISPA 2.0과 DASH를 이용한 메타게놈 분석

Sensitive, flexible, and affordable serum RNA sequencing for pathogen detection on the Oxford Nanopore platform

Nanopore 기반 저비용 병원체 검출: SISPA 2.0 프로토콜

 

PCR 없이도 병원체를 검출할 수 있을까?
이 연구는 Nanopore 기반 메타게놈 분석으로 이를 가능하게 만든 방법을 제시합니다.

 

연구 개요

본 연구에서는 혈청(serum) 샘플에서 병원체를 검출하기 위한 Nanopore 기반 메타게놈 시퀀싱 프로토콜을 개선하여, 기존 방법 대비 더 높은 민감도와 낮은 비용을 동시에 달성한 SISPA 2.0 방법을 제시하였습니다.

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연구 배경

기존 병원체 검출 방법은 다음과 같은 한계가 있습니다.

• PCR 기반 → 특정 병원체만 검출 가능
• 변이 많을 경우 검출 어려움
• 동시 감염(co-infection) 탐지 불가

반면 metagenomics는:

• 모든 유전체를 비선택적으로 분석 가능
• 새로운 병원체 탐지 가능

하지만 문제: host DNA/RNA가 대부분 → 민감도 낮음

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연구 목적

• 저비용으로 host nucleic acid 제거
• 병원체 검출 민감도 향상
• 다양한 종에 적용 가능한 범용 프로토콜 개발

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핵심 방법: SISPA 2.0

기존 SISPA + DASH(CRISPR/Cas9 기반 제거) 결합

주요 구성

• SISPA (Sequence-independent amplification)
• DASH (CRISPR 기반 host depletion)
• Nanopore sequencing

핵심:
“host 제거 + 비타겟 증폭 + long-read 분석”

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주요 결과

1) 민감도 향상

• 기존 SISPA 대비:
  • 최대 10배 이상 향상
• HIV 검출:
  • 100 copies/mL까지 검출 가능 (PCR 수준)

→ PCR 수준 민감도 달성

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2) 기존 방법 대비 성능

• 기존 SISPA 대비: 7.7배 향상
• SMART-9N 대비: 2.7배 향상

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3) 비용 절감

• 기존 방법: ~146 EUR/sample
• SISPA 2.0: ~59 EUR/sample

→ 약 2.5배 저렴

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4) host 제거 성능

• rRNA 거의 1% 이하로 감소
• virus detection 증가

→ DASH가 commercial kit보다 우수

이 그림은 다양한 host 제거 방법(DASH, DNase, nuclease 등)이 메타게놈 시퀀싱에서 host 유래 RNA와 바이러스 RNA의 검출에 미치는 영향을 비교한 결과이다. 특히 CRISPR/Cas9 기반의 DASH를 적용한 경우, 18S, 28S와 같은 rRNA를 포함한 host RNA가 효과적으로 제거되면서 라이브러리 내 불필요한 신호가 감소하고, 그 결과 바이러스 RNA의 상대적인 비율과 검출 민감도가 크게 향상되는 것을 확인할 수 있다.

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5) nuclease 방식 문제

• pre-extraction nuclease:
  • 바이러스 RNA까지 손상 가능
  • 실제 임상 샘플에서 감도 감소

→ DASH 방식이 더 안정적

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6) dsRNA 검출 개선

• 95℃ denaturation 도입 시
  → 최대 200배 이상 검출 증가

이 그림은 역전사(RT) 이전에 수행되는 열 변성(heat denaturation) 단계가 RNA 바이러스 검출에 미치는 영향을 보여준다. 이중가닥 RNA 바이러스(Orthoreovirus, Rotavirus)의 경우 고온 변성 처리를 통해 검출 효율이 크게 증가하는 반면, 단일가닥 RNA 바이러스(PDV, TBEV, DENV2)는 변성 조건 및 RT 이후 열 처리 조건에 따라 검출 효율이 달라지는 것을 확인할 수 있다.

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7) 전체 핵심 성능

결과 요약:

• 높은 민감도
• 낮은 비용
• 다양한 병원체 탐지 가능
• field 적용 가능

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종류	바이러스
대표 테스트	PDV, DENV
ssRNA	ZIKV, CHIKV, TBEV
dsRNA	Rotavirus, Orthoreovirus
segmented	Influenza B, RVF
민감도 테스트	HIV
기타	mpox

 

본 연구에서는 PDV와 Dengue virus를 중심으로 Zika, Chikungunya, Influenza, Rotavirus, HIV 등 다양한 RNA 바이러스를 사용하여 프로토콜의 성능을 평가하였다. 이를 통해 서로 다른 유전체 구조와 특성을 가진 바이러스에 대해 검출 성능을 종합적으로 검증하였습니다.

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실험 방법

샘플 준비

• 인간 혈청 샘플 사용
• 바이러스 spike-in (DENV, ZIKV, HIV 등)

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RNA 추출

• NucleoSpin Virus kit 사용
• DNase 처리 수행

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SISPA

1. random primer 기반 cDNA 합성
2. second strand synthesis
3. PCR 증폭

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DASH (핵심 단계)

• CRISPR/Cas9 + sgRNA 사용
• 타겟:
  • rRNA (18S, 28S, 12S, 16S)
  • mitochondrial RNA

→ host RNA 선택적 제거

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시퀀싱

• Oxford Nanopore MinION 사용
• 24~48시간 run

본 연구에서는 기존의 ligation 기반 바코딩 대신, PCR primer에 바코드를 포함시키는 방식(PCR barcoding)을 사용하였다. 이를 통해 실험 과정을 단순화하고 비용과 오염 위험을 줄이면서도, 더 긴 read와 향상된 바이러스 검출 성능을 확보할 수 있었습니다.

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데이터 분석

• basecalling (Guppy/Dorado)
• filtering
• alignment (Minimap2)
• metagenomic 분석

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Nanopore 시퀀싱으로 얻은 데이터는 여러 단계의 분석 과정을 거쳐 병원체 검출에 활용되었습니다.

 

먼저 Guppy 또는 Dorado를 이용해 raw 신호 데이터를 염기서열로 변환(basecalling)하고, 양쪽에 바코드가 존재하는 read만 선별하여 샘플별로 분리하였습니다. 

 

이후 Q score 9 이상인 read만 유지하고, 200 bp 이하의 짧은 서열과 low-complexity read를 제거하여 데이터 품질을 정제하였습니다. 추가적인 필터링은 PRINSEQ++를 사용하여 수행하였습니다. 

 

전처리 과정에서는 primer 및 adapter 서열을 제거하였으며, custom Python 스크립트를 이용해 trimming을 진행하였습니다. 

 

정제된 read는 Minimap2를 이용하여 reference genome에 정렬하였으며, Samtools를 활용해 정렬 결과를 정리하고 coverage 및 read 통계를 계산하였습니다.

 

이후 각 바이러스 및 host에 해당하는 read 수와 염기 수를 기반으로, 전체 라이브러리 내에서 바이러스가 차지하는 비율을 정량적으로 분석하였습니다.

 

또한 Chan Zuckerberg ID (CZ ID) 플랫폼을 활용하여 병원체를 분류하고, 외부 오염 여부를 확인하였습니다.

 

최종적으로 matplotlib을 이용해 coverage 분포와 분석 결과를 시각화하였습니다.

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핵심 해석

이 연구는 기존 메타게놈 방식의 가장 큰 문제였던, host contamination 문제를 효과적으로 해결한 사례입니다.

특히,

• CRISPR 기반 제거 (DASH)
• 비타겟 증폭 (SISPA)
• Nanopore long-read

→ 이 3가지 조합이 핵심입니다.

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연구의 의미

• 저자원 환경에서도 사용 가능
• 신종 바이러스 탐지 가능
• 공중보건 감시에 활용 가능

→ 특히 zoonotic disease 연구에 매우 중요

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한줄 요약

CRISPR 기반 host 제거(DASH)와 SISPA를 결합한 Nanopore 메타게놈 분석은, 저비용으로 PCR 수준의 민감도를 가진 병원체 검출을 가능하게 한다.

https://link.springer.com/article/10.1186/s12864-025-12268-4