Library Prep (Rapid Kits)
- 왜 Rapid Adapter(RA)를 희석해야 하나요?
V14 화학에서 DNA 캡처 효율이 향상되었습니다. 이는 자유 어댑터(free adapter)가 이전보다 더 쉽게 시퀀싱된다는 것을 의미합니다. 이를 보완하기 위해 DNA 라이브러리에 첨가되는 Rapid Adapter(RA) 양이 줄어들었으며, 보다 용이한 피펫팅을 위해 어댑터를 희석할 것을 권장합니다. 항상 당사 프로토콜의 지침을 따라 제품을 올바르게 사용하는 것을 권장합니다.
- 현장에서 어떤 키트를 사용할 수 있나요?
SQK-RAD114 또는 SQK-RBK114.24/96을 사용할 수 있습니다!
저희는 다양한 온도 조건에서 안정성과 성능을 테스트했습니다:
- 장기 보관을 위해서는 가능하다면 여전히 -20ºC 보관을 권장합니다.
- 실온(25ºC)에서는 안전하게 1–2주 보관할 수 있습니다.
- 4ºC에서는 최대 4주 보관이 가능합니다.
- SQK-RBK114.96으로 몇 개의 플로우셀을 운용할 수 있나요?
SQK-RBK114.96에는 실험의 유연성을 위해 충분한 버퍼가 추가로 포함되어 있습니다. 따라서 다음과 같이 선택적으로 준비할 수 있습니다:
- 96개 바코드를 포함한 3개의 라이브러리 또는 플로우셀
- 48개 바코드를 포함한 6개의 라이브러리 또는 플로우셀
- 24개 바코드를 포함한 12개의 라이브러리 또는 플로우셀
또한, 자동화를 지원하기 위해 총 24 µl의 Rapid Barcodes가 3개의 플레이트에 제공됩니다.
- Rapid Chemistry Kit에서 트랜스포자아제는 어떻게 작동하나요?
- 희석한 Rapid Adapter(RA)는 어떻게 보관해야 하나요?
각 라이브러리 준비 및 시퀀싱 실험마다 신선하게 희석한 Rapid Adapter(RA)를 준비할 것을 권장합니다. 시퀀싱 키트에는 각 준비 과정마다 새로운 RA 희석을 만들 수 있도록 충분한 여유 시약이 포함되어 있습니다. 하루 동안 여러 개의 플로우셀을 로딩하는 경우, 희석한 RA는 얼음 위 또는 4ºC에서 같은 날 여러 번 사용할 수 있습니다. 단, 12시간 이상 얼음 위나 4ºC에서 보관하는 것은 권장하지 않습니다.
- Rapid Kit에서 작은 DNA 조각을 사용할 수 있나요?
최적의 결과를 위해 gDNA 실험에서는 고품질의 고분자량 DNA(N50 > 30kb) 사용을 권장합니다. 그러나 더 짧은 DNA 조각을 시퀀싱하더라도 좋은 결과를 얻을 수 있습니다. 다만 Rapid Sequencing Kit은 트랜스포제이스 기반 화학을 사용하기 때문에, 500 nt 이하의 조각 길이로 시작하는 것은 권장하지 않습니다. Amplicon 시퀀싱을 원할 경우, Rapid Barcoding Amplicon Sequencing 프로토콜을 참고하시기 바랍니다.
Library Prep (Ligation Based Kits)
- 왜 NBD114.24에서는 DNA 수선 및 end-prep 후 정제(clean-up) 단계가 필요하지만, NBD114.96에서는 필요하지 않나요?
이는 두 프로토콜 간에 end-prep DNA를 다음 단계로 가져가는 부피 차이 때문입니다.
- NBD114.24: 7.5 µL
- NBD114.96: 0.75 µL
NBD114.24의 경우, UltraII 및 FFPE 수선 키트에서 효소의 잔여물이 함께 넘어가는 것을 최소화하기 위해 정제 단계가 필요합니다.
- 왜 라이브러리 준비 과정에서 DNA 수선(DNA repair)을 해야 하나요?
DNA 수선(NEBNext® FFPE 사용)은 염기 손상과 절단부(nick)를 복구해 줍니다. 만약 DNA 수선을 하지 않으면 시퀀싱 결과에 부정적인 영향을 줄 수 있습니다. 또한 시퀀싱 어댑터를 연결하기 전에 DNA에 dA-tailing 과정을 거쳐야 합니다. 당사 프로토콜에 따라, FFPE 수선과 dA-tailing 단계는 하나의 과정으로 결합되어 진행됩니다.
- Short Fragment Buffer(SFB)와 Long Fragment Buffer(LFB) 중 무엇을 사용해야 하나요?
- 3 kb 이상의 DNA 조각을 농축하려면 Long Fragment Buffer(LFB)를 사용하세요.
- DNA 조각이 3 kb 미만이라면, 모든 크기의 DNA 조각을 보존하기 위해 Short Fragment Buffer(SFB)를 사용하세요.
- EDTA 바이알이 다 떨어졌는데 어떻게 해야 하나요?
EDTA 바이알이 부족하다면, 0.25M EDTA를 사용하고 프로토콜에 있는 파란색 뚜껑 EDTA 지침을 따라 사용하면 됩니다.
- 라이브러리 준비 과정에서 정제 단계에 반드시 SPRI beads를 사용해야 하나요?
네. 저희는 프로토콜에 명시된 모든 시약을 검증했으며, SPRI beads를 포함한 해당 시약들만 사용하는 것을 권장합니다.
- 네이티브 바코드 연결에서 Blunt T/A 대신 DNA T4 Ligase를 사용할 수 있나요?
아니요. 프로토콜은 최적화되어 있으며, 바코드 연결에는 Blunt T/A가 더 효과적인 것으로 확인되었습니다. 저희는 프로토콜에 명시된 제3자 시약만 검증 및 권장하고 있습니다.
- 다른 브랜드의 T4 ligase를 사용할 수 있나요?
나노포어 시퀀싱을 처음 사용하는 고객이라면 NEBNext® Companion Module for Oxford Nanopore Technologies® Ligation Sequencing (카탈로그 번호 E7180) 구입을 권장합니다. 저희는 프로토콜에 명시된 제3자 시약만 검증 및 권장하며, 다른 T4 ligase는 테스트하지 않았습니다.
- end-prep 단계를 생략할 수 있나요?
아니요. end-prep 단계는 어댑터 연결을 위해 DNA를 준비하는 데 반드시 필요합니다. 심지어 A-tail을 추가하는 중합효소로 PCR을 수행한 경우에도, 최적의 연결을 위해서는 end-prep 단계를 거쳐야 합니다.
Library Prep (Kit Descriptions and Use)
- 왜 시퀀싱 키트가 Early Access 상태인가요?
저희는 최신이자 최상의 제품을 가능한 한 빨리 고객이 사용할 수 있도록 제공하는 것을 목표로 합니다. 이를 통해 고객은 제품을 최대한 활용할 수 있으며, 저희는 피드백과 정보를 받아 경험을 개선할 수 있습니다. 이러한 제품은 최종 검증 및 안정성 테스트가 진행 중이므로, 짧은 공지 기간 내 변경될 수 있으며 보증 기간은 최소 1개월입니다. 자세한 내용은 각 제품의 스토어 페이지를 확인하시기 바랍니다.
- Ultra-Long DNA Sequencing Kit(SQK-ULK114)이란 무엇인가요?
Ultra-Long DNA Sequencing Kit은 초고분자량 DNA(uHMW)를 시퀀싱에 적합하게 준비할 수 있는 방법을 제공합니다. 이를 통해 N50 > 50 kb를 달성할 수 있으며, 최대 4 Mb 이상의 리드를 얻을 수 있음이 확인되었습니다.
- Rapid Sequencing Kit(SQK-RAD114)이란 무엇인가요?
Rapid Sequencing Kit V14 (SQK-RAD114)는 속도와 단순성에 최적화된 단독 키트로, PCR-free 방식으로 라이브러리를 시퀀싱할 수 있습니다. 또한 이 키트는 현장(field) 시퀀싱을 원하는 사용자에게도 적합합니다.
- Rapid PCR Sequencing Kit(SQK-RPB114.24)이란 무엇인가요?
Rapid PCR Barcoding Kit은 적은 양의 gDNA 샘플(1–5 ng)을 사용할 때, 바코드가 적용된 라이브러리를 가장 빠르고 간단하게 준비할 수 있는 방법을 제공합니다.
- Direct RNA Sequencing Kit(SQK-RNA004)이란 무엇인가요?
Direct RNA Sequencing Kit은 네이티브 RNA를 준비하고 시퀀싱하는 데 사용됩니다. 사용 가능한 입력물은 poly(A) tail이 있는 RNA 또는 total RNA, 예를 들어 진핵 mRNA 및 바이러스 RNA가 포함됩니다.
- 16S Sequencing Kit(SQK-16S114.24)이란 무엇인가요?
16S Barcoding Kit은 최대 24개 샘플에 대해 바코딩을 적용하여 세균을 속(genus) 수준에서 식별할 수 있도록 해줍니다.
- Q20+ Chemistry (Kit V14)이란 무엇인가요?
Q20+ Kit V14 화학 키트는 최신 버전의 시퀀싱 키트로, 단일 패스(single-pass)에서 Q20+ (99%+) 정확도를 달성하도록 설계되었습니다.
- Legacy Chemistry란 무엇인가요?
저희는 기존의 많은 시퀀싱 화학 키트들을 스토어의 새로운 Legacy 페이지로 이동시켰습니다. 이는 고객이 최신이자 최상의 제품 라인으로 전환할 수 있도록 돕는 동시에, 제품 구성을 간소화하기 위함입니다. 추가 정보는 웹사이트의 해당 페이지에서 확인하시기 바랍니다:https://nanoporetech.com/discontinued-kits
- Early Access란 무엇인가요?
공개 Early Access 제품은 모든 사용자가 사용할 수 있으며, 스토어에서 직접 구매 가능합니다. 이러한 제품은 최종 검증 및 안정성 테스트 진행 중이므로, 짧은 공지 기간 내 변경될 수 있으며 보증 기간은 최소 1개월입니다. 자세한 내용은 각 제품의 스토어 페이지를 참고하시기 바랍니다.
- Closed Access란 무엇인가요?
저희는 제품 개발 주기 중에 선정된 사용자를 대상으로 Closed Access 프로그램을 운영하여, 제품을 최적화하고 기능을 테스트하기도 합니다. Closed Access 제품은 아직 개발 중이며 변경이 진행되는 단계에 있습니다. 참여를 원하신다면, Register Your Interest(RYI) 기회와 관련된 공지 사항 및 Nanopore Community 게시물을 확인하시기 바랍니다.
- Released란 무엇을 의미하나요?
완전히 출시된 제품(Released products)은 모든 사용자가 사용할 수 있으며, 스토어에서 바로 구매 가능합니다. 완전히 출시된 제품은 3개월 이상 보증이 제공되며, 제품에 변경 사항이 있을 경우 3–12개월 전에 사전 공지됩니다. 자세한 정보는 각 제품의 스토어 페이지를 참고하시기 바랍니다.
- Rapid Barcoding Kit(SQK-RBK114.24 및 SQK-RBK114.96)이란 무엇인가요?
Rapid Barcoding Kit은 단순성과 속도에 최적화된 단독 키트로, PCR-free 방식을 사용하여 최대 96개 샘플을 시퀀싱할 수 있습니다.
- Native Barcoding Kit(SQK-NBD114.24, SQK-NBD114.96)과 Multiplex Ligation Kit(SQK-MLK114.96XL)이란 무엇인가요?
저희 Native Barcoding Kit과 Multiplex Ligation Kit은 최대 96개의 고유 바코드를 제공하여, gDNA 및 amplicon과 같은 dsDNA 샘플을 PCR-free 방식으로 멀티플렉싱할 수 있도록 합니다.
- Ligation Sequencing Kit(SQK-LSK114 및 SQK-LSK114-XL)이란 무엇인가요?
Ligation Sequencing Kit은 dsDNA(gDNA, cDNA, amplicon 등)에서 시퀀싱 라이브러리를 준비할 수 있는 유연한 방법을 제공합니다.
- cDNA-PCR Sequencing Kit(SQK-PCS114 및 SQK-PCB114.24)이란 무엇인가요?
cDNA-PCR Sequencing Kit은 poly(A)+ RNA 또는 total RNA로부터 cDNA를 준비하여 나노포어 시퀀싱을 수행하는 데 사용됩니다.
- Singleplex 옵션: 단일 샘플에서 최대 출력 확보 가능
- Multiplexing 옵션: 최대 24개 샘플을 동시에 시퀀싱하여 비용 절감 가능
- Legacy 키트와 V14 키트를 R9.4.1 및 R10.4.1 플로우셀에서 섞어 사용할 수 있나요?
아니요!
- V14 화학 키트는 오직 R10.4.1 플로우셀에서만 사용할 수 있습니다:
- Flongle: FLO-FLG114
- MinION / GridION: FLO-MIN114
- PromethION: FLO-PRO114M
- Legacy 화학 키트(Kit V14 이전 버전, 예: SQK-LSK109)는 오직 R9.4.1 플로우셀에서만 사용할 수 있습니다.
또한, 판매량이 낮거나 이전 세대의 시퀀싱 화학 키트들은 스토어의 Legacy 페이지로 이동되었으며, 이를 통해 사용자가 최신이자 최상의 제품 라인으로 전환할 수 있도록 하고, 제품 구성을 단순화하였습니다.
Library Prep (Kit Contents and Composition)
- BSA의 기능은 무엇인가요?
BSA(Bovine Serum Albumin)는 플로우셀 내의 비특이적 결합을 차단하여, 더 많은 DNA 가닥이 나노포어에 이용될 수 있도록 합니다. 이를 통해 시퀀싱 출력량을 증가시킬 수 있습니다.
- 권장: MinION·GridION의 R10.4.1 플로우셀(FLO-MIN114)에서 V14 키트 시퀀싱 런의 전체 성능 향상이 관찰되어 BSA 추가를 권장합니다.
- 비권장: Flongle 및 PromethION에서는 BSA 추가에 따른 성능 변화(긍정/부정)가 관찰되지 않아 넣지 않는 것을 권장합니다.
- Control Lambda 바이알(LMD)이란 무엇인가요?
LMD(Lambda DNA control)은 Lambda control 실험에 사용되는 기준 DNA를 포함하고 있으며, 이는 Enterobacteria phage lambda의 전체 게놈입니다. (서열 정보: here)
- 농도: 50 ng/μL
- Control Expansion Kit (EXP-CTL001)에 포함되어 있습니다.
- 버퍼, 어댑터, 프라이머의 구성 및 농도는 무엇인가요?
해당 정보는 저희의 화학 기술 문서(Chemistry technical document)에서 확인할 수 있습니다.
여기서 공개되지 않은 상세 내용은 자사 고유 정보이므로 제공되지 않습니다.
- DNA CS(DCS)란 무엇인가요?
DNA CS(DCS)는 DNA control strand로, Lambda 게놈의 3' 말단에 매핑되는 3.6 kb 표준 amplicon입니다. 이는 품질 확인을 위한 양성 대조 샘플로 사용되며, 라이브러리 준비 과정에서 샘플 실패와 라이브러리 준비 실패를 구분하는 데 도움을 줍니다.
- 농도: 10 ng/µL
- 서열 정보: 별도 링크에서 확인 가능 (링크)
- 포함 키트: Ligation Sequencing Kit에 포함되어 있습니다.
- 키트에 필요한 시약이 다 떨어졌습니다. 어떻게 해야 하나요?
나노포어 스토어에서는 다양한 Expansion Pack 및 보조(Auxiliary) Pack을 제공합니다. 추가 시약의 구입 가능 여부와 호환성을 확인하려면 Nanopore Store의 Expansion Packs 페이지를 확인하시기 바랍니다.
- 내 EDTA 바이알의 농도를 어떻게 알 수 있나요?
파란색 뚜껑(신규 버전): 0.25M EDTA
또한, 농도는 배치 번호에서도 구분할 수 있습니다:
- 신규 농도(0.25M): 예) NBD1424.20.0001, NBD1424.20.0002 이상 형식
- 구형 농도(0.5M): 예) NBD1424.10.0001 형식
- 플로우셀 프라이밍 믹스에 BSA를 사용해야 하나요?
비권장: Flongle 및 PromethION에서는 BSA 추가에 따른 성능 변화(긍정/부정)가 관찰되지 않아 넣지 않는 것을 권장합니다.
이전 화학(레거시): 과거 화학에서도 BSA의 성능 영향이 관찰되지 않았습니다.
실험에서 BSA 사용 시점과 방법은 공식 프로토콜의 지침을 따라 주세요. 또한 재조합 알부민(recombinant albumin)의 사용은 권장하지 않습니다.
- 이전에 사용하던 화학 키트의 남은 시약을 새로운 V14 화학 키트와 함께 사용할 수 있나요?
아니요. 기존 키트와 Kit V14 화학은 역호환(backwards compatibility)이 되지 않습니다. V14 키트에서는 성능과 안정성을 높이기 위해 여러 버퍼가 재구성되었으므로, 서로 다른 키트의 시약을 섞어서 사용해서는 안 됩니다.
Library Prep (General Library Prep FAQS)
- 왜 Native/Rapid Barcoding Kit이 바이알이 아니라 바코딩 플레이트로 왔나요?
이제 SQK-NBD114.24와 SQK-RBK114.24의 24개 바코드 바이알은 96웰 포맷으로 제공됩니다. 각 웰에는 한 번의 반응에 충분한 바코드와 약간의 여유 부피가 들어 있습니다. 바코드는 2개의 스커트형 PCR 플레이트로 제공되며, 동봉된 시약은 총 6회 반응에 충분합니다. 중요한 점은, 키트에 포함된 실제 시약은 변경되지 않았으며, 단지 포장 방식만 변경되었다는 것입니다. 첨부된 이미지는 이러한 변화를 보여주며, 앞으로 해당 변경이 적용되는 키트의 배치 번호도 함께 표시합니다.
- 라이브러리 준비 프로토콜은 어디에서 찾을 수 있나요?
라이브러리 준비 프로토콜은 Nanopore Community의 Documentation 탭에서 확인할 수 있습니다.
- 시퀀싱 어댑터에 대한 정보는 어디에서 찾을 수 있나요?
이 정보는 저희의 화학 기술 문서(Chemistry Technical Document)에서 확인할 수 있습니다.
- 플로우셀에 얼마나 많은 라이브러리를 로딩해야 하나요?
최적의 시퀀싱 결과를 위해서는 공식 프로토콜에 명시된 플로우셀 로딩 권장량을 따르는 것을 권장합니다.
자세한 정보와 프로토콜은 Nanopore Community의 Documentation 공간에서 확인하실 수 있습니다.
- 서로 다른 키트의 시약을 함께 사용할 수 있나요?
아니요. 시퀀싱 키트 간의 구성품은 상호 교환하여 사용할 수 없습니다.
- 프로토콜에서 권장하는 것보다 적은 초기 입력량을 사용할 수 있나요?
저희 제품을 올바르게 사용하려면 항상 공식 프로토콜의 지침을 따르는 것을 권장합니다. 초기 입력량이 적으면 라이브러리 수율, 포어 점유율, 데이터 생성량이 모두 감소하게 됩니다. 또한, 응용별 프로토콜에서는 일반 키트 프로토콜과 입력 요구량이 다를 수 있으니 반드시 해당 프로토콜을 확인하시기 바랍니다.
- 프로토콜에 권장된 장비나 소모품 대신 다른 것을 사용할 수 있나요?
저희는 프로토콜을 따르는 것을 권장합니다. 프로토콜에 명시된 장비와 소모품은 해당 방법과 함께 검증된 것들이기 때문입니다.
- DNA 라이브러리를 보관할 수 있나요?
네, 가능합니다!
- 단기 보관 또는 반복 사용: Eppendorf LoBind 튜브에 담아 4 °C에서 보관
- 단일 사용 또는 3개월 이상 장기 보관: -80 °C에서 보관
실험을 언제, 어떻게 중단하거나 DNA 라이브러리를 보관해야 하는지에 대한 권장 사항은 공식 프로토콜을 따라주시기 바랍니다. 추가 정보는 DNA Library Stability know-how 자료에서 확인하실 수 있습니다.
Library Prep (General Lab Practice)
- 어떤 종류의 피펫을 사용해야 하나요?
플로우셀 관련 작업: 사용자 제어를 극대화하기 위해 단일 채널 수동 피펫(single-channel mechanical pipette) 사용을 권장합니다. 다만, 장비를 저희 방법에 맞게 검증했다면 전자 피펫(electronic pipette)도 적합할 수 있습니다.
항상 응용에 맞는 올바른 피펫 용량을 사용하고, 정확한 측정을 위해 장비가 적절히 보정(calibration)되어 있는지 확인해야 합니다.
- Eppendorf DNA LoBind® 튜브는 얼마나 중요한가요?
저희는 샘플 라이브러리의 최대 회수율을 보장하기 위해 LoBind 튜브 사용을 권장합니다. 다른 튜브도 사용할 수는 있지만, 테스트되지 않았기 때문에 권장하지 않습니다.
- 라이브러리 준비 과정에서 DNA 절단(shearing)을 어떻게 방지할 수 있나요?
와이드 보어 팁 사용: wide-bore 피펫 팁을 사용하면 샘플 및 라이브러리 준비 중 DNA 절단을 줄이는 데 도움이 됩니다.
샘플 보관 지침 준수: 최적의 결과를 얻기 위해 항상 문서에 명시된 샘플 보관 권장 사항을 따라야 합니다.
- nuclease-free water를 반드시 사용해야 하나요?
네. 모든 실험에서 nuclease-free water를 사용해야 DNA/RNA의 분해 및 오염 위험을 줄일 수 있습니다. 그 외의 물은 분자생물학 실험이나 나노포어 시퀀싱에는 적합하지 않습니다.
- 다른 DNA 정제 시약이나 방법을 사용할 수 있나요?
저희는 프로토콜에 명시된 제3자 시약과 방법만 검증 및 권장합니다. 자세한 내용은 Nanopore Community의 Extraction Methods 페이지를 참고하시기 바랍니다. 또한, 모든 제3자 시약은 제조사의 사용 지침에 따라 준비해 사용하는 것을 권장합니다.
- 프로토콜에 제시된 것과 다른 시약을 사용할 수 있나요?
저희는 프로토콜에 명시된 제3자 시약만 검증 및 권장합니다. 또한, 모든 제3자 시약은 반드시 제조사의 사용 지침에 따라 준비해 사용하는 것을 권장합니다.
Library Prep (Extraction and Input)
- 플라스미드 추출에 가장 적합한 추출 키트는 무엇인가요?
플라스미드 추출에는 Qiagen Plasmid Plus Midi Kit를 권장합니다. 시퀀싱을 위해서는 Rapid Barcoding 키트와 Rapid sequencing V14 - Plasmid sequencing 프로토콜(SQK-RBK114.24 또는 SQK-RBK114.96) 사용을 권장합니다.
- DNA 샘플의 품질이 좋지 않다면 어떻게 해야 하나요?
저희는 고품질 DNA 샘플 사용을 권장하며, 샘플 내에 존재할 수 있는 오염물은 반드시 제거해야 합니다.
추가 정보는 다음 자료에서 확인할 수 있습니다:
- 화학 기술 문서(Chemistry technical document)의 Sample input and recommendations 섹션
- Contaminants 정보 페이지
- gDNA 절편화를 위한 절단(shearing) 방법에는 어떤 것이 있나요?
- 기계적 절단: 라이브러리 준비 전, Covaris g-Tube를 이용한 샘플 입력물의 기계적 절단은 선택적으로 수행할 수 있습니다.
- 효소적 절단: Rapid 접근법에서는 필수 단계이며, 자세한 내용은 화학 기술 문서(technical document)를 참고하시기 바랍니다.
- 기타 방법: 당사 팀에서 검증한 추가 gDNA 절편화 방법에 대한 가이드와 정보는 Optional fragmentation of gDNA 페이지에서 제공됩니다.
항상 제품 사용 시에는 공식 프로토콜의 지침을 따르는 것을 권장합니다.
- 샘플은 어떻게 정량해야 하나요?
권장 방법: DNA 및 RNA 샘플은 Qubit을 사용해 정량하는 것을 권장합니다.
프로토콜 준수: 제품 사용 시에는 항상 공식 프로토콜 지침을 따라야 합니다.
비권장 방법: 다른 방법들은 오염물의 영향을 받아 샘플 농도를 과대평가할 수 있으므로 권장하지 않습니다.
- DNA나 RNA의 품질은 얼마나 중요한가요?
DNA/RNA의 품질은 나노포어 시퀀싱 실험의 성공에 필수적입니다.
라이브러리 준비를 시작하기 전에 반드시 입력 DNA/RNA의 품질을 확인하는 것이 중요합니다.
저분자량 샘플, 잘못 정량된 샘플, 오염된 샘플은 시퀀싱 성능에 큰 영향을 줄 수 있습니다.
추가 정보는 다음 자료를 참고하시기 바랍니다:
- 샘플에서 긴 DNA 조각을 보존하려면 어떻게 해야 하나요?
긴 길이의 DNA 입력물/라이브러리를 보존하고 절단(shearing)을 최소화하기 위해 다음을 권장합니다:
- 샘플과 시약을 매우 부드럽게 혼합하세요
- 긴 DNA 샘플은 Voltaxing을 피하세요
- wide-bore 피펫 팁을 사용하면 샘플 및 라이브러리 준비 과정에서 DNA 절단을 줄이는 데 도움이 됩니다.
- 최적의 결과를 위해 프로토콜에 명시된 샘플 보관 지침을 따르세요.
- DNA 샘플은 어떻게 추출하나요?
Oxford Nanopore 팀에서 검증한 추출 방법은 Nanopore Community의 Extraction Protocols 섹션에서 확인할 수 있습니다. 또한 추출 후에는 반드시 DNA/RNA 추출물의 품질과 양을 평가하여, 최적의 시퀀싱 성능 요구 사항을 충족하는지 확인하는 것이 중요합니다.
- 추출 후 일부 DNA가 절단되었는데, 정상인가요?
네, 정상입니다. DNA는 추출 과정뿐만 아니라 취급 및 피펫팅 과정에서도 절단(shearing)될 수 있습니다. 또한 추출된 DNA의 길이는 샘플 보존 상태에 따라 달라집니다. 샘플이 잘 보존된 경우 더 긴 DNA를 유지할 수 있습니다.
- 동결과 해동을 반복하면 DNA 안정성에 영향을 주나요?
네. 샘플의 동결-해동 사이클은 최소화하는 것이 좋습니다. 반복되면 시료가 분해되거나 리드 길이가 줄어들 수 있습니다. 자세한 내용은 DNA stability-freeze/thaw 자료를 참고하시기 바랍니다.
Library Prep (RNA and cDNA)
- SQK-RNA004와 함께 어떤 플로우셀을 사용할 수 있나요?
SQK-RNA004는 다음 플로우셀에서만 호환됩니다:
- MinION/GridION: FLO-MIN004RA
- PromethION: FLO-PRO004RA
- Direct RNA 시퀀싱을 위한 추출 방법은 무엇을 권장하나요?
검증된 추출 방법은 Nanopore Community의 Extraction Protocols 섹션에서 확인할 수 있습니다. 만약 RNA 응용에 적합한 프로토콜을 찾을 수 없다면, 일반적으로 Trizol 기반 또는 TRI-reagent 추출 방법을 권장합니다.
- Direct RNA 시퀀싱 프로토콜은 어디에서 찾을 수 있나요?
프로토콜은 Nanopore Community에서 확인할 수 있습니다:
- RNA Integrity Number(RIN)이란 무엇인가요?
RNA Integrity Number(RIN)은 추출된 RNA의 분해 정도를 1에서 10까지의 척도로 측정하는 품질 관리 지표입니다. 숫자가 클수록(10에 가까울수록) 분해가 적습니다. 라이브러리 준비를 진행하기 전, RIN 값이 7 이상인 샘플을 사용하는 것을 권장합니다. 자세한 내용은 Nanopore know-how 섹션의 RNA stability 글에서 확인할 수 있습니다.
- Direct RNA 시퀀싱의 최소 조각 길이는 얼마인가요?
현재 Direct RNA 시퀀싱의 최소 조각 길이는 200 nt입니다.
- RNA/cDNA 라이브러리 준비에 rRNA가 존재하면 어떤 영향이 있나요?
rRNA가 존재하면 라이브러리 준비에 필요한 poly(A)+ RNA 입력물의 정량에 영향을 줄 수 있습니다. 따라서 라이브러리 준비 전에 rRNA 제거(ribodepletion)를 통해 poly(A)+ RNA를 선택하거나, poly(A)+ RNA를 농축할 것을 권장합니다. 자세한 poly(A)+ RNA 선택 방법은 Nanopore know-how 섹션에서 확인할 수 있습니다.
- RNA Control Strand(RCS) 바이알의 농도는 얼마인가요?
새로운 배치의 SQK-RNA004 및 EXP-RCS001에서는 RNA CS(RCS) 바이알의 농도가 증가되었습니다.
SQK-RNA004
- 배치 RNA004.20.001 이하: 15 ng/µl
- 배치 RNA004.30.0001 이상: 50 ng/µl
SQK-RCS001
- 배치 RCS001.10.0004 이하: 15 ng/µl
- 배치 RCS001.20.0001 이상: 50 ng/µl
- RNA CS(RCS)란 무엇인가요?
RNA CS(RCS)는 RNA Calibration Strand로, YHR174W 유래 Enolase II입니다.
해당 전사체(transcript)는 1,314 nt 길이이며, 여기에 30 nt poly(A) tail이 추가되어 있습니다. 참조 fasta 파일은 YHR174W ENO2 mRNA로 제공되며 다운로드할 수 있습니다.
- 포함 키트: Direct RNA Sequencing Kit(SQK-RNA004)에 포함
- RNA Control Expansion(EXP-RCS001): RCS가 담긴 3개의 튜브 포함
- 농도 변화:
15 ng/µl → (배치 RNA004.20.0001 이하, RCS001.10.0004 이하)
50 ng/µl → (배치 RNA004.30.001 이상, RCS001.20.0001 이상)
- SQK-RNA004에서 권장하는 초기 RNA 투입량은 얼마인가요?
저희 제품을 올바르게 사용하려면 항상 공식 프로토콜의 지침을 따르시기 바랍니다. 초기 입력량이 적으면 라이브러리 수율, 포어 점유율, 데이터 생성량이 감소합니다.
- RNA 또는 cDNA 키트에서 total RNA를 입력물로 사용할 수 있나요?
네. Direct RNA Sequencing Kit(SQK-RNA004)와 cDNA 키트(SQK-PCS114, SQK-PCB114.24) 모두에서 total RNA를 입력물로 사용할 수 있습니다. 자세한 내용은 각 키트의 관련 프로토콜을 참고하시기 바랍니다.
- RNA 플로우셀을 세척해서 재사용할 수 있나요?
네, 가능합니다.
RNase 기반 세척 키트는 없지만, Flow Cell Wash Kit(EXP-WSH004 또는 EXP-WSH004-XL)을 사용해 RNA 플로우셀을 재사용할 수 있습니다. 다만 다음 사항을 유의해야 합니다:
- 이 세척 키트는 Direct RNA 시퀀싱에서 막힌 포어를 복구하는 뉴클레아제 플러시 역할은 하지 못합니다.
- 대신 새로운 샘플을 로딩하기 위한 플러시 기능을 합니다. 즉, 대부분의 라이브러리를 플로우셀에서 제거하고, 남아 있는 샘플에서 모든 어댑터를 제거하여 더 이상 캡처·시퀀싱되지 않도록 합니다. 이를 통해 추가 라이브러리 로딩이 가능해집니다.
- 세척 후에는 두 번째 라이브러리를 로딩하기 전에 반드시 플로우셀을 프라이밍해야 합니다.
- SQK-RNA004에 다른 RT 효소를 사용할 수 있나요?
저희는 프로토콜에 명시된 제3자 시약만 검증 및 권장합니다.
또한 모든 제3자 시약은 제조사 사용 지침에 따라 준비해 사용할 것을 권장합니다.
- SQK-RNA004로 만든 RNA 라이브러리를 나중에 사용하기 위해 보관할 수 있나요?
저희는 역전사 및 정제 단계 이후(어댑터 연결 전)의 RNA:cDNA hybrid만 -80ºC에서 보관할 것을 권장합니다. 한편, RNA Ligation Adapter(RLA)가 연결된 후에는 가능한 한 빨리 플로우셀에서 런을 진행하는 것이 좋습니다.
- SQK-RNA004 프로토콜에서 RT 단계를 생략할 수 있나요?
생략하는 것은 권장하지 않습니다. RT 단계를 건너뛰면 포어 블로킹이 증가하여 시퀀싱 출력이 크게 저하됩니다. 제품을 올바르게 사용하려면 항상 공식 프로토콜의 지침을 따르는 것을 권장합니다.
- SQK-RNA004로 준비한 RNA 라이브러리를 R10.4.1 플로우셀에서 시퀀싱할 수 있나요?
아니요. SQK-RNA004 시퀀싱 키트는 RNA 전용 플로우셀(FLO-MIN004RA, FLO-PRO004RA)에서만 호환됩니다.
- RNA 플로우셀에서 DNA를 시퀀싱할 수 있나요?
아니요. RNA 플로우셀(FLO-MIN004RA, FLO-PRO004RA)은 SQK-RNA004 키트와 함께 RNA 시퀀싱 전용으로만 사용됩니다.
- SQK-RNA004에서 멀티플렉싱이나 바코딩을 할 수 있나요?
현재 Direct RNA 시퀀싱에서는 멀티플렉싱이 지원되지 않습니다.
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