Long read sequencing enhances pathogenic and novel variation discovery in patients with rare diseases
Oxford Nanopore Technologies의 PromethION 플랫폼을 활용하여 희귀질환 환자들의 유전체를 분석하였습니다. 이 연구는 특히 기존의 짧은 읽기 시퀀싱으로 진단되지 않았던 환자들에게서 새로운 병원성 변이와 후성유전학적 이상을 발견하는 데 중점을 두었습니다.
PromethION을 활용한 유전체 분석 방법
연구팀은 PromethION 장비를 사용하여 환자들의 전장 유전체를 시퀀싱하였습니다. 이 과정에서 평균 30배 이상의 커버리지(coverage)와 12kb 이상의 N50 읽기 길이를 확보하였습니다. 이러한 긴 읽기 길이는 구조적 변이(SV)와 반복 확장 영역을 정확하게 탐지하는 데 유리합니다. 시퀀싱된 데이터는 다음과 같은 분석 파이프라인을 통해 처리되었습니다:
- Basecalling 및 정렬: Guppy와 Minimap2를 사용하여 시퀀싱된 데이터를 처리하고, GRCh37/hg19 참조 유전체에 정렬하였습니다.
- 변이 탐지: Epi2Me의 wf-human-variation 워크플로우를 활용하여 CNV, SV, SNP, 메틸레이션 변이를 탐지하였습니다.
- 후성유전학적 분석: Epimarker 모듈을 통해 36개의 Mendelian 신경발달장애와 관련된 에피시그니처를 스캔하였습니다.
PromethION을 활용한 진단 사례
이 연구에서는 PromethION을 활용하여 여러 희귀질환 환자들에게서 기존 기술로는 발견되지 않았던 변이들을 탐지하였습니다:
- Angelman 증후군 환자(OXN-18): 15q11.2 영역에서의 메틸레이션 손실을 감지하였으며, SNP 분석을 통해 15번 염색체 전반에 걸친 이형접합성 손실(LOH)을 확인하였습니다. 이는 부계 단일 친자 이염색체(pUPD)로 인한 질환 메커니즘을 시사합니다.
- Spinal Muscular Atrophy(SMA) 환자: SMN1 유전자와 그 유사 유전자인 SMN2에서의 메틸레이션 프로파일을 분석하여, 기존 기술로는 감지하기 어려웠던 후성유전학적 변이를 발견하였습니다.
- 기타 구조적 변이: 여러 환자들에게서 대형 삽입 및 결실 변이, 복잡한 재배열 등을 탐지하여, 질환의 유전적 원인을 규명하는 데 성공하였습니다.
a. 분석 흐름도 (Study Design and Workflow)
Positive/Negative 환자 그룹과 최적화 샘플 그룹을 설정하고, CNV, SV, 단일 변이, 메틸레이션 변이를 단계별로 필터링하여 최종 진단 가능한 후보를 선별하는 분석 흐름을 나타냅니다.
b. CNV 및 SV 변이 탐지 결과 (Counts of CNV/SV Calls)
다양한 도구(DNAseq, Sniffles, CuteSV)를 이용해 탐지한 CNV와 SV 변이 개수를 보여줍니다. 품질 필터를 거친 후 질병 관련 유전자에 영향을 주는 변이들을 추려냈습니다.
c. SMN1 메틸레이션 분석 (SMN1 Methylation Profile Analysis)
SMN1 유전자 영역의 메틸레이션 패턴을 분석하여, SMA 양성, SMA 보인자(carrier), 음성 그룹을 구별하는 heatmap과 IGV 뷰어 결과를 보여줍니다.
d. 환자 성별 및 인종 분포 (Patient Gender and Ethnicity Distribution)
연구에 포함된 환자들의 성별 및 인종(아시아인/비아시아인) 비율을 나타냅니다.
e. 주요 임상 증상 분포 (Clinical Symptom Categories)
연구 환자들에서 가장 많이 나타난 주요 임상 증상군을 나타냅니다. 신경계 이상(Neurology)이 가장 높은 비율을 차지했습니다.
결론
PromethION 플랫폼을 활용한 롱리드 시퀀싱은 희귀질환 환자들의 유전체 분석에서 기존 기술로는 감지하기 어려웠던 변이들을 정확하게 탐지할 수 있는 강력한 도구입니다. 특히 구조적 변이, 반복 확장, 후성유전학적 이상 등을 포괄적으로 분석할 수 있어, 진단율을 높이고 환자 맞춤형 치료 전략 수립에 기여할 수 있습니다.
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