Strain-level characterization of foodborne pathogens without culture enrichment for outbreak investigation using shotgun metagenomics facilitated with nanopore adaptive sampling
식품 속 병원균을 분석하는 데 있어 가장 큰 걸림돌 중 하나는 바로 배양 과정입니다. 전통적인 방법은 시간이 오래 걸리고, 배양이 되지 않는 균주는 분석조차 어렵습니다. 그런데 최근, 배양 없이도 균주 수준(strain-level)까지 병원균을 식별할 수 있는 방법이 발표되었습니다. 핵심은 Oxford Nanopore의 어댑티브 샘플링(adaptive sampling)과 샷건 메타게놈 시퀀싱의 결합입니다.
기술 개요: 실시간 선택적 시퀀싱으로 정확도 향상
연구팀은 감자에 오염된 Staphylococcus aureus 샘플을 대상으로 실험을 진행했습니다. 나노포어의 어댑티브 샘플링 기능을 활용해 식품 자체의 DNA(예: 감자 DNA)는 실시간으로 제거하고, 병원균 DNA만을 선별적으로 시퀀싱했습니다.
- 병원균 전용 타겟 서열을 세팅하여 시퀀싱 효율 향상
- DNA 추출 키트 종류에 따른 성능 비교
- 독소 유전자, 항생제 내성 유전자를 포함한 핵심 병원성 유전자까지 분석
이러한 접근 방식은 전체 샘플에서 병원균 유전체 정보를 더 정확히 추출하고, 계통수 상에서 균주의 위치까지 파악하는 데 성공했습니다.
Strain-level 분석이란?
Strain-level 분석은 단순한 종(species) 수준을 넘어서, 같은 종 안에서도 유전적으로 어떤 변이가 있는지, 아웃브레이크의 감염원이 동일한 균주인지를 판별하는 데 사용됩니다. 이 연구는 배양 없이도 그 수준까지 분석이 가능하다는 점에서 매우 의미가 큽니다.
Strain-level 확인 방식 요약
1. 어댑티브 샘플링으로 타겟 DNA 선택
- Staphylococcus aureus 유전체를 기준으로 mmi 파일을 만들고, 비교할 타겟 유전체(S. aureus NCTC 8325 등)와 일치하는 리드만 선택적으로 시퀀싱했어요.
- 동시에 감자의 유전체(식물 DNA)는 실시간으로 시퀀싱 거부(unblock)되도록 해서 미생물 리드의 비율을 높였습니다.
2. 롱리드 기반으로 전체 유전체에서 다양한 변이 확보
- 나노포어 기술의 특성상 long-read를 확보할 수 있고, 이는 짧은 리드 기반 기술보다 리드 하나로 여러 변이를 커버할 수 있습니다.
- 특히, 전체 유전체에서의 SNP(단일 염기 다형성) 패턴을 분석해 아웃브레이크 관련 균주 간의 미세한 유전적 차이를 확인할 수 있게 되죠.
3. qPCR로 타겟 유전자(enterotoxin A) 존재 확인
- 시퀀싱 전후로 qPCR을 이용해 sea 유전자의 존재 여부를 검증했어요.
- 이는 해당 균주가 실제로 toxigenic strain인지 확인할 수 있는 중요한 지표입니다.
4. 메타지놈 리드 → strain 분류 및 계통 분석
- 시퀀싱 후 데이터 분석 과정에서, 다음 도구들을 사용해 strain-level 확인을 수행했어요:
| 분석 도구 | 역할 |
| Kraken2 | S. aureus 리드 분류 |
| Metamaps | S. aureus 리드만 추출 |
| Blastn | enterotoxin 유전자 검색 |
| bwa mem + SMALT + SAMtools | SNP 매핑 및 분석 |
| Bcftools | SNP 마스킹 및 컨센서스 시퀀스 생성 |
| MEGA + iTOL | 계통수 구성 → outbreak 관련 균주들과 비교 분석 |
나노포어 기술의 차별점
- 어댑티브 샘플링: 실시간으로 특정 DNA 서열만 선택
- 장기 리드(long-read) 시퀀싱으로 균주 간 유전적 차이까지 분석
- 빠른 타임라인 → 아웃브레이크 대응 속도 향상
이 기술은 식품안전, 임상, 환경 등 다양한 분야에서 배양이 어려운 병원균을 빠르게 strain-level까지 식별해야 할 때 강력한 대안이 될 수 있습니다.
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