Oxford Nanopore Salmonella 신속 혈청형 분석

Oxford Nanopore, Direct-from-Colony Salmonella 시퀀싱 워크플로우 공개

 

Oxford Nanopore Technologies(ONT)는 Direct-from-Colony Microbial Sequencing 포트폴리오의 첫 번째 워크플로우로 Rapid Salmonella Identification & Serotyping 프로토콜을 새롭게 공개했습니다.

 

이번 워크플로우는 Rapid PCR Barcoding Kit 24 V14(SQK-RPB114.24)를 이용하여 Salmonella 단일 콜로니(Single Colony)에서 직접 라이브러리를 제작하고, Whole Genome Sequencing(WGS)을 통해 빠르게 균종 확인(Identification), 혈청형(Serotyping), MLST, 항생제 내성(AMR)까지 분석할 수 있는 End-to-End 솔루션입니다.

 

기존에는 단일 콜로니를 액체 배지에서 추가 배양한 후 DNA를 추출해야 했지만, 이번 워크플로우는 배양과 DNA 추출 과정을 생략하여 보다 빠르게 결과를 얻을 수 있도록 설계되었습니다.

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Direct-from-Colony Sequencing이란?

Direct-from-Colony Sequencing은 배양된 단일 콜로니에서 바로 시퀀싱 라이브러리를 제작하는 방법입니다.

기존 워크플로우는

• 액체 배양(Subculture)
• Genomic DNA 추출

과정을 거쳐야 했지만,

이번 방법은 2~3 mm 크기의 단일 콜로니만 있으면 바로 라이브러리를 제작할 수 있습니다.

이를 통해 실험 시간을 크게 단축하고 보다 신속한 병원체 분석이 가능합니다.

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워크플로우의 주요 특징

이번 워크플로우는 다음과 같은 특징을 제공합니다.

• Direct-from-Colony 방식
• DNA 추출 과정 불필요
• 액체 배양(Subculture) 불필요
• 최대 24개 샘플 동시 분석(Multiplexing)
• Rapid PCR Barcoding Kit 24 V14(SQK-RPB114.24) 사용
• Whole Genome Sequencing(WGS) 기반 분석
• Salmonella Identification
• Salmonella Serotyping
• MLST 분석
• 항생제 내성 유전자(AMR) 분석
• EPI2ME wf-bacterial-genomes 자동 분석 지원

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Library Preparation

라이브러리 준비는 Rapid PCR Barcoding Kit 24 V14(SQK-RPB114.24)를 이용하여 수행됩니다.

전체 과정은 매우 간단합니다.

1. 2~3 mm 크기의 단일 콜로니 채취
2. Fragmentation Mix를 이용한 Tagmentation
3. PCR을 통한 Barcode 부착
4. Rapid Sequencing Adapter 연결
5. MinION R10.4.1 Flow Cell(FLO-MIN114)에 로딩

특히 DNA 추출 없이 바로 라이브러리를 제작할 수 있다는 점이 가장 큰 특징입니다.

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왜 Rapid PCR Barcoding Kit를 사용할까?

이번 워크플로우는 Rapid PCR Barcoding Kit의 Tagmentation 기반 라이브러리 준비 방식을 활용합니다.

이를 통해

• 빠른 라이브러리 준비
• 최대 24개 샘플 멀티플렉싱
• Whole Genome Sequencing 수행
• 짧은 Turnaround Time

을 실현할 수 있습니다.

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시퀀싱 전략

ONT에서는 샘플당 최소 50,000 Reads 확보를 권장합니다.

50,000 Reads만 확보해도 다음과 같은 분석이 가능합니다.

• Salmonella Serotype
• Multi-Locus Sequence Typing (MLST)
• 항생제 내성(AMR) 분석

샘플 수에 따라 권장 시퀀싱 시간은 달라집니다.

• 약 2시간 (6개 샘플)
• 최대 12시간 (24개 샘플)

실험 목적과 멀티플렉싱 수에 따라 런타임을 선택할 수 있습니다.

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데이터 분석

시퀀싱 후에는 EPI2ME의 wf-bacterial-genomes 워크플로우를 이용하여 자동으로 분석할 수 있습니다.

이 워크플로우는 Nextflow 기반으로 개발되었으며,

다음과 같은 분석을 수행합니다.

• De novo Assembly
• Reference-based Assembly
• Genome Annotation
• Salmonella Serotyping
• MLST
• 항생제 내성 유전자(AMR) 분석

모든 결과는 HTML Report 형태로 자동 생성됩니다.

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분석 결과

Workflow 실행 후 다음과 같은 결과를 확인할 수 있습니다.

• Species Identification
• Salmonella Serotype
• MLST 결과
• Genome Assembly
• Annotation
• AMR Profile
• QC Report
• Coverage Summary

이를 통해 균주의 특성을 빠르게 파악할 수 있습니다.

더보기: 분석 결과 예시

데이터 분석

시퀀싱 완료 후에는 EPI2ME의 wf-bacterial-genomes 워크플로우를 사용하여 자동으로 유전체 조립, 주석(Annotation), AMR 분석, MLST 및 혈청형 분석(Salmonella 전용)을 수행할 수 있습니다. 결과 리포트에는 그래프와 시각화된 분석 결과가 포함되어 있어 샘플의 상태와 분류 결과를 한눈에 확인할 수 있습니다.

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실험 결과:

No.	Serotype	PCR product conc. (ng/ul)	Predicted serotype	Predicted antigenic profile	matching status
1	Enteritidis	17.6	Enteritidis	9:g,m:-	O
2	Typhimurium	61.4	Typhimurium	4:i:1,2	O
3	I 4,[5],12:i:-	40.8	I 4,[5],12:i:-	4:i:-	O
4	Bareilly	46.8	Bareilly	7:y:1,5	O
5	Infantis	32.8	Infantis	7:r:1,5	O
6	Agona	39.6	Agona	4:f,g,s:-	O
7	Livingstone	29	Livingstone	7:d:l,w	O
8	Stanley	48.8	Stanley	4:d:1,2	O
9	Montevideo	46.8	Montevideo	7:g,m,s:-	O
10	Panama	56	Panama	9:l,v:1,5	O
11	Negative control	0.188	-	-	-
12	Negative control	low	-	-	-
• Required Concentration: 15-20 ng/uL for sequencing.

 

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기존 Salmonella 분석과 무엇이 다를까?

항목	기존 Workflow	ONT Direct-from-Colony Workflow
액체 배양(Subculture)	필요	불필요
DNA 추출	필요	불필요
라이브러리 준비	일반 Workflow	Rapid PCR Barcoding
Whole Genome Sequencing	가능	가능
Serotyping	가능	가능
MLST	가능	가능
AMR 분석	가능	가능
분석 시간	상대적으로 김	대폭 단축

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어떤 연구에 활용될 수 있을까?

이번 워크플로우는 다음과 같은 분야에 활용할 수 있습니다.

• 식중독 원인균 분석
• Salmonella Surveillance
• 공중보건(Public Health)
• 식품 미생물학
• 임상 미생물학
• 감염병 연구
• 항생제 내성(AMR) 연구
• Whole Genome Sequencing 기반 균주 분석

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마무리

이번 Direct-from-Colony Microbial Sequencing Workflow는 Oxford Nanopore의 새로운 미생물 시퀀싱 포트폴리오의 첫 번째 프로토콜로, Salmonella 단일 콜로니에서 직접 Whole Genome Sequencing을 수행할 수 있는 End-to-End 솔루션입니다.

 

특히 액체 배양과 DNA 추출 과정을 생략하고 단일 콜로니에서 바로 라이브러리를 제작할 수 있어 실험 시간을 크게 단축할 수 있으며, Salmonella 혈청형(Serotyping), MLST, 항생제 내성(AMR)까지 하나의 워크플로우에서 분석할 수 있습니다.

 

또한 EPI2ME의 wf-bacterial-genomes 워크플로우를 통해 Assembly부터 Annotation, Serotyping, AMR 분석까지 자동화되어 있어 식품안전, 공중보건, 임상 미생물학 분야에서 신속한 균주 분석에 유용한 솔루션이 될 것으로 기대됩니다.

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참고 자료

Workflow Protocol

• Direct-from-colony microbial sequencing: Rapid Salmonella Serotyping (SQK-RPB114.24)

Data Analysis

• EPI2ME wf-bacterial-genomes Workflow
• EPI2ME Desktop 설치 가이드
• EPI2ME Quick Start Guide

Know-how

• Rapid Salmonella Sequencing Know-how Document