Oxford Nanopore Rapid Metagenomic Sequencing 공개

Oxford Nanopore Rapid Metagenomic Sequencing 공개 – 세균·진균·바이러스 병원체를 빠르게 검출하는 End-to-End 워크플로우

 

Oxford Nanopore Technologies(ONT)는 Rapid Metagenomic Sequencing for Surveillance of Bacterial, Fungal and Viral Pathogens 워크플로우를 새롭게 공개했습니다.

 

이번 워크플로우는 Rapid Barcoding Kit(SQK-RPB114.24)를 기반으로 하며, 박테리아, 진균(곰팡이), 바이러스 등 다양한 병원체를 하나의 실험에서 빠르게 검출할 수 있도록 설계된 End-to-End 메타게놈 시퀀싱 솔루션입니다.

 

특히 샘플 전처리부터 라이브러리 준비, 시퀀싱, EPI2ME 기반 데이터 분석까지 하나의 워크플로우로 구성되어 있어 호흡기 감염을 포함한 다양한 감염성 질환 연구 및 병원체 감시에 활용할 수 있습니다.

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Rapid Metagenomic Sequencing이란?

기존의 병원체 검사는 배양(Culture)이나 PCR 기반 분석이 주로 사용되었습니다.

 

하지만 배양은 시간이 오래 걸리고, PCR은 미리 알고 있는 병원체만 검출할 수 있다는 한계가 있습니다.

반면 Metagenomic Sequencing은 특정 병원체를 미리 가정하지 않고 시료 내 존재하는 모든 미생물의 유전체를 분석하는 Agnostic Metagenomics 방식입니다.

 

이를 통해 세균, 진균, 바이러스를 동시에 분석할 수 있으며, 예상하지 못한 병원체까지 확인할 수 있다는 장점이 있습니다.

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SQK-RPB114.24 Workflow의 주요 특징

이번 워크플로우는 다음과 같은 특징을 제공합니다.

• Rapid Barcoding Kit(SQK-RPB114.24) 기반
• 세균·진균·바이러스 동시 검출
• End-to-End 메타게놈 분석
• 최대 24개 샘플 멀티플렉싱
• 호흡기 검체를 포함한 다양한 샘플 적용 가능
• EPI2ME wf-metagenomics 자동 분석 지원
• 항생제 내성 유전자(AMR) 분석 지원
• 메타게놈 조립(Assembly) 및 계통분석(Phylogeny) 지원

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샘플 준비 방법

시료 종류에 따라 서로 다른 전처리 과정을 거친 후 하나의 라이브러리로 통합합니다.

세균 및 진균 샘플

1. Host Depletion (Saponin 처리)
2. DNA 추출
3. Tagmentation
4. PCR

바이러스 샘플

1. Background 제거
2. 핵산 추출
3. SMART-9N Reverse Transcription
4. PCR

이후 두 라이브러리를 하나로 Pooling한 뒤 Adapter를 부착하여 시퀀싱을 수행합니다.

최대 24개의 샘플을 동시에 바코딩하여 분석할 수 있습니다.

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데이터 분석

생성된 데이터는 EPI2ME Labs의 wf-metagenomics 워크플로우를 이용하여 자동으로 분석됩니다.

분석 결과에서는 다음과 같은 정보를 확인할 수 있습니다.

• 병원체 동정(Species Identification)
• 상대적 풍부도(Relative Abundance)
• 항생제 내성 유전자(AMR) 분석
• 메타게놈 조립(Assembly)
• 계통분석(Phylogenetic Analysis)

분석 결과는 직관적인 HTML 리포트 형태로 제공됩니다.

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성능 검증(Inclusivity Panel Test)

ONT는 ZeptoMetrix사의 Respiratory Panel 2.1(RP2.1)를 이용하여 워크플로우의 성능을 검증했습니다.

Control Panel 1과 Panel 2를 이용한 평가에서 20종 이상의 바이러스, 세균, 비정형 세균을 성공적으로 검출하였습니다.

이를 통해 다양한 호흡기 병원체를 하나의 실험으로 동시에 확인할 수 있음을 입증했습니다.

Table 1:  Organisms/viruses in Respiratory Panel 2.1 (RP2.1) controls.

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검출 한계(Detection Limit)

다양한 병원체를 이용한 검출 한계 평가 결과는 다음과 같습니다.

병원체검출	한계
Adenovirus	약 10³ copies/mL
Influenza virus	약 10³~10⁴ copies/mL
Escherichia coli	약 10³ CFU/mL
Staphylococcus aureus	약 10³ CFU/mL
Candida albicans	약 10² CFU/mL

낮은 농도의 병원체에서도 안정적인 검출이 가능함을 확인했습니다.

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멀티플렉싱 성능

SQK-RPB114.24는 최대 24개 샘플을 하나의 Flow Cell에서 분석할 수 있습니다.

 

Dual-arm 워크플로우에서는 11개 샘플과 NTC를 함께 운영할 수 있으며, 분석 목적에 따라 런타임을 조절할 수 있습니다.

 

24시간과 72시간 시퀀싱을 비교하면 총 데이터 생산량은 증가하지만, 샘플 수가 많을수록 개별 샘플의 커버리지는 감소하므로 목적에 맞는 런타임 설정이 중요합니다.

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Sample Normalisation이 중요한 이유

ONT는 Know-how 문서에서 Sample Normalisation의 중요성을 강조하고 있습니다.

정규화를 수행하지 않으면 샘플 간 데이터 생산량이 크게 차이날 수 있습니다.

예를 들어

• 최소 0.5 Gb
• 최대 7.1 Gb

까지 약 13배의 차이가 발생할 수 있습니다.

 

반면 Sample Normalisation을 수행하면 각 바코드 간 데이터 편차가 크게 줄어들어 보다 균일한 결과를 얻을 수 있습니다.

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Host Depletion은 왜 중요할까?

호흡기 검체에서는 사람 DNA가 병원체 DNA보다 훨씬 많이 존재합니다.

 

특히 객담(Sputum) 샘플에서는 사람 DNA가 병원체보다 약 10⁵배 이상 많을 수 있으며, Host Depletion을 수행하지 않으면 전체 리드의 약 96% 이상이 사람 DNA로 구성될 수 있습니다.

 

Host Depletion을 수행한 결과

• 세균 리드 : 40.85배 증가
• 바이러스 리드 : 9.16배 증가
• 전체 병원체 리드 : 17.67배 증가

하는 것으로 확인되었습니다.

 

또한 ZeptoMetrix Control 2에서는 Host Depletion을 수행하지 않았을 경우 Bordetella pertussis와 Bordetella parapertussis가 검출되지 않는 사례도 확인되었습니다.

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어떤 연구에 활용될 수 있을까?

이번 워크플로우는 다음과 같은 분야에 활용할 수 있습니다.

• 호흡기 감염 연구
• 병원체 감시(Surveillance)
• 감염병 연구
• 임상 미생물학
• 공중보건(Public Health)
• 항생제 내성(AMR) 연구
• 메타게놈 연구

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마무리

이번 Rapid Metagenomic Sequencing Workflow는 단순한 메타게놈 분석 프로토콜이 아니라, 샘플 준비부터 병원체 검출, 항생제 내성 분석, 메타게놈 조립까지 포함하는 완전한 End-to-End 솔루션입니다.

 

또한 Oxford Nanopore는 워크플로우와 함께 Know-how 문서를 공개하여 실제 실험에서 중요한 Host Depletion, Sample Normalisation, Detection Limit, Multiplexing 전략까지 상세히 공유하고 있습니다.

 

특히 낮은 농도의 병원체 검출 성능과 다양한 호흡기 병원체에 대한 검증 결과를 통해, 감염병 연구와 공중보건 분야에서 Rapid Metagenomic Sequencing의 활용 가능성을 보여주는 워크플로우라고 할 수 있습니다.

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참고 자료

더 자세한 내용은 아래의 공식 자료를 참고하시기 바랍니다.

• Rapid Metagenomic Sequencing Protocol (SQK-RPB114.24)
  https://nanoporetech.com/document/rapid-sequencing-metagenomics-sqk-rpb114-24
• Rapid Metagenomic Sequencing Know-how Document
  https://nanoporetech.com/document/requirements/rapid-metagenomic-sequencing-for-surveillance-of-bacterial-fungal-and-viral-pathogens-using-sqk-rpb114-24-know-how-document
• EPI2ME wf-metagenomics Workflow
  https://epi2me.nanoporetech.com/epi2me-docs/workflows/wf-metagenomics/