RNA를 있는 그대로 분석하는 기술, Oxford Nanopore Direct RNA Sequencing

RNA를 있는 그대로 분석하는 기술, Oxford Nanopore Direct RNA Sequencing

 

전사체(transcriptome) 분석은 생명과학 연구에서 유전자 발현을 이해하기 위한 핵심 기술로 자리 잡았습니다. RNA sequencing(RNA-seq)은 세포에서 어떤 유전자가 발현되고 있는지뿐만 아니라, 대체 스플라이싱(alternative splicing), 전사체 구조(transcript structure), 유전자 발현량 등을 분석하는 데 널리 활용되고 있습니다.

 

그러나 대부분의 기존 RNA sequencing 방법은 RNA를 직접 분석하는 것이 아니라, 먼저 RNA를 cDNA로 역전사(reverse transcription)한 뒤 PCR 증폭을 거쳐 시퀀싱을 수행합니다. 이러한 과정은 높은 정확도와 처리량을 제공하지만, RNA가 가진 고유한 생물학적 정보를 일부 잃게 되는 한계도 함께 가지고 있습니다.

 

Oxford Nanopore Technologies의 Direct RNA Sequencing(DRS) 은 이러한 한계를 극복하기 위해 개발된 기술입니다. 이 기술은 RNA를 cDNA로 변환하지 않고 native RNA 분자를 직접 읽음으로써, 전사체(transcriptome)와 에피트랜스크립톰(epitranscriptome)을 하나의 실험에서 동시에 분석할 수 있는 새로운 접근법을 제공합니다.

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RNA를 '있는 그대로' 분석한다는 의미

RNA는 단순히 DNA와 단백질을 연결하는 중간 매개체가 아닙니다. RNA 자체는 다양한 화학적 변형(RNA modification)을 포함하고 있으며, 이러한 변형은 RNA의 안정성, 스플라이싱, 번역 효율 및 세포 기능 조절에 중요한 역할을 합니다.

 

대표적인 RNA modification인 N6-methyladenosine (m6A) 는 mRNA의 스플라이싱, 안정성 및 번역 효율을 조절하는 것으로 알려져 있으며, 최근에는 암, 신경질환, 면역반응 등 다양한 생물학적 현상과의 연관성이 활발히 연구되고 있습니다. 하지만 이러한 RNA modification의 기능을 정확히 이해하기 위해서는 RNA가 원래 가지고 있는 상태(native RNA)를 그대로 분석하는 것이 무엇보다 중요합니다.

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기존 RNA-seq가 가지는 한계

기존 RNA sequencing의 일반적인 워크플로우는 다음과 같습니다.

RNA → Reverse Transcription → cDNA → PCR Amplification → Sequencing

 

이 과정에서는 몇 가지 중요한 제한점이 발생합니다.

• 첫째, Reverse transcription 과정에서 RNA modification 정보가 대부분 사라집니다. RNA를 DNA로 변환하는 순간 RNA 특유의 화학적 정보는 유지되지 않기 때문에, 이후 분석은 원래 RNA가 아닌 cDNA를 기반으로 이루어집니다.
• 둘째, PCR 증폭 과정에서 증폭 편향(PCR bias) 이 발생할 수 있습니다. 일부 transcript는 과도하게 증폭되고, 일부는 상대적으로 적게 증폭되어 실제 발현량과 차이가 생길 수 있습니다.
• 셋째, Short-read sequencing은 RNA를 여러 개의 짧은 조각으로 분절하여 분석하기 때문에, transcript isoform이나 복잡한 alternative splicing 구조를 정확하게 재구성하는 데 한계가 있습니다. 또한 RNA modification과 isoform 정보를 동일한 RNA 분자에서 연결하여 해석하는 것도 어렵습니다.

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Direct RNA Sequencing의 차별점

Oxford Nanopore의 Direct RNA Sequencing은 이러한 문제를 해결하기 위해 RNA 분자를 직접 nanopore를 통과시키며 분석합니다. RNA 분자가 nanopore를 통과할 때 발생하는 전류 변화를 실시간으로 측정하고, 이를 인공지능 기반 basecalling 알고리즘이 해석하여 RNA 염기서열을 복원합니다. 이 과정은 PCR 증폭을 필요로 하지 않으며, RNA 분자를 처음부터 끝까지 하나의 연속된 read로 분석하기 때문에 native RNA의 정보를 최대한 보존한 상태에서 분석이 가능합니다.

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하나의 실험으로 Transcriptome과 Epitranscriptome을 동시에 분석

Direct RNA Sequencing의 가장 큰 특징은 단순히 RNA 염기서열을 확인하는 것이 아니라, RNA 분자가 가지고 있는 다양한 생물학적 정보를 하나의 실험에서 동시에 확보할 수 있다는 점입니다. Full-length read를 통해 transcript isoform과 splice junction을 정확하게 확인할 수 있으며, 동시에 RNA modification을 동일한 RNA 분자에서 분석할 수 있습니다.

즉, "어떤 isoform에서 어떤 RNA modification이 존재하는가"를 하나의 read에서 직접 연결하여 해석할 수 있습니다. 이러한 분석은 기존 short-read RNA sequencing에서는 사실상 불가능했던 영역입니다.

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최대 8종의 RNA Modification 동시 분석

현재 Oxford Nanopore의 Direct RNA Sequencing은 하나의 실험에서 다음과 같은 8종의 RNA modification을 동시에 분석할 수 있습니다.

• m6A (N6-methyladenosine)
• Inosine
• m5C (5-methylcytidine)
• Pseudouridine (Ψ)
• 2'-O-methyladenosine (2'-OMe-A)
• 2'-O-methylcytidine (2'-OMe-C)
• 2'-O-methylguanosine (2'-OMe-G)
• 2'-O-methyluridine (2'-OMe-U)

이를 통해 transcriptome과 epitranscriptome을 통합적으로 분석할 수 있으며, RNA modification의 위치뿐 아니라 동일한 RNA 분자 내에서의 co-modification 패턴까지 연구할 수 있습니다.

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최근 업데이트: Direct RNA Sequencing도 Multiplex 시대

Direct RNA Sequencing은 오랫동안 뛰어난 분석 능력을 제공했지만, 한 번의 실험에서 하나의 샘플만 분석할 수 있다는 점이 활용상의 제약으로 지적되어 왔습니다.

 

최근 Oxford Nanopore는 Direct RNA Barcoding Kit (SQK-DRB004.24) 를 출시하면서 이러한 제약을 크게 개선했습니다. 새로운 바코딩 키트를 이용하면 최대 24개의 poly(A)+ RNA 샘플을 하나의 Flow Cell에서 동시에 분석할 수 있으며, 실험 목적에 따라 필요한 read depth를 고려해 4~24개의 샘플을 유연하게 multiplex할 수 있습니다.

 

또한 새로운 바코딩 프로토콜은 barcode 간 균형 있는 read 분포를 유지하도록 최적화되었으며, 기존 Singleplex Direct RNA Sequencing과 비교하여 read length, sequencing output, 그리고 RNA modification 검출 정확도를 유지하도록 설계되었습니다. 이는 Direct RNA Sequencing의 가장 큰 장점인 native RNA 분석 성능을 그대로 유지하면서도, 샘플 처리량과 비용 효율성을 크게 향상시킨 중요한 발전이라고 할 수 있습니다.

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마무리

Oxford Nanopore의 Direct RNA Sequencing은 단순히 RNA 염기서열을 확인하는 기술이 아닙니다. RNA를 있는 그대로(native RNA) 읽음으로써 transcriptome과 epitranscriptome을 하나의 실험에서 동시에 분석할 수 있는 플랫폼입니다. 

 

Full-length transcript 분석, RNA modification 검출, PCR bias 최소화, 그리고 최근 추가된 최대 24개 샘플 multiplex 기능까지 더해지면서, Direct RNA Sequencing은 전사체 연구를 넘어 RNA biology를 이해하기 위한 핵심 기술로 자리매김하고 있습니다. 

 

앞으로 암, 희귀질환, 감염병, 신경과학, 식물생명과학 등 다양한 분야에서 Direct RNA Sequencing의 활용은 더욱 확대될 것으로 기대됩니다.

https://nanoporetech.com/resource-centre/flyer-direct-rna-sequencing-kits