Oxford Nanopore Long-read Metagenomics로 항생제 내성까지 한 번에! BRD 진단 성능 평가 논문 리뷰

Evaluating the Diagnostic Performance of Long- Read Metagenomic Sequencing Compared to Culture and Antimicrobial Susceptibility Testing for Detection of Bovine Respiratory Bacteria and Indicators of Antimicrobial Resistance

Oxford Nanopore Long-read Metagenomics는 배양검사를 대체할 수 있을까?

소 호흡기 질환(BRD) 진단에서 Long-read Metagenomics의 진단 성능 평가

 

최근 Oxford Nanopore의 Long-read metagenomic sequencing은 감염병 진단 분야에서 빠르게 활용 범위를 넓혀가고 있습니다.

이번에는 사람이 아니라 소(Bovine Respiratory Disease, BRD) 를 대상으로

• 병원균 검출
• 항생제 내성 유전자(ARG) 검출
• 기존 배양검사(Culture) + AST와의 비교

를 수행한 매우 흥미로운 논문이 발표되었습니다.

무엇보다도 이 논문은 "Long-read metagenomics가 실제 임상에서 얼마나 신뢰할 수 있는가?" 를 정량적으로 평가한 최초의 대규모 연구 중 하나입니다.

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왜 이 연구가 중요한가?

현재 세균 감염 진단은 대부분

1. 배양(Culture)
2. 균 동정
3. AST(항생제 감수성 검사)

순으로 진행됩니다.

하지만 문제는

• 결과까지 수일이 필요
• 살아있는 균이 있어야 함
• 배양되지 않는 균은 확인 불가
• 내성 유전자 확인 불가

라는 한계가 있습니다.

반면 Nanopore metagenomics는

한 번의 sequencing으로

• 어떤 균인지
• 어떤 항생제 내성 유전자를 갖고 있는지

동시에 확인할 수 있습니다.

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연구 목적

이번 연구의 목적은 매우 명확합니다.

Long-read metagenomics가

기존

• Culture
• AST

만큼 정확한지 평가하는 것입니다.

평가 대상은 BRD의 대표 병원균인

• Mannheimia haemolytica
• Pasteurella multocida
• Histophilus somni

입니다.

또한 항생제 내성 유전자

• tet(H)
• msrE
• mphE
• EstT

도 함께 평가했습니다.

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실험 방법

이번 논문의 가장 흥미로운 부분입니다.

1. 실험 동물

총 1,600마리의 송아지

를 대상으로 연구를 수행했습니다.

• 2020년 : 800마리
• 2021년 : 800마리

캐나다 연구용 Feedlot에서 사육하였습니다.

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2. 시료 채취

깊은 비인두 면봉 (Deep Nasopharyngeal Swab, DNPS)을 이용했습니다.

채취 시점은

• 입식 직후(Day 1)
• 13일
• 36일

총 3회였습니다.

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3. 동일 샘플을 두 가지 방법으로 분석

기존 방법

• Bacterial culture
• MALDI-TOF 균 동정
• Broth microdilution AST

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Nanopore 방법

동일 샘플에 대해 Long-read metagenomic sequencing을 수행했습니다.

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Metagenomics 실험 Workflow

논문의 실험은 다음과 같은 순서로 진행되었습니다.

DNPS 채취
↓
Bacterial enrichment (BHI + 1% glucose)
↓
Host DNA 감소
↓
DNA extraction
↓
Library preparation
(SQK-LSK109)
↓
Native barcoding
↓
PromethION24 sequencing
↓
Basecalling
↓
Kraken2
↓
Bracken
↓
AMRFinderPlus
↓
CARD database
↓
ARG detection

 

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샘플 전처리

이 연구에서는 일반적인 shotgun sequencing보다 한 단계가 추가되었습니다.

바로 Bacterial enrichment 입니다.

DNPS를 Brain Heart Infusion(BHI) 배지에서 약 10~14시간 배양하여 병원균 DNA를 충분히 증폭시켰습니다.

그 후 DNA extraction을 수행했습니다. 이 단계 덕분에 Pasteurellaceae 균들의 sequencing depth가 크게 증가했습니다.

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Sequencing

Oxford Nanopore PromethION24를 사용했습니다.

Library는

• SQK-LSK109
• Native Barcode

를 사용하여 제작했습니다.

High Accuracy basecalling으로 수행하였으며,

• 2021 샘플은 72시간
• 2020 샘플은 후속 분석 결과를 반영해 48시간

시퀀싱했습니다.

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Bioinformatics Pipeline

Pipeline 역시 상당히 정교합니다.

Quality control

• Porechop
• NanoFilt
• NanoStat

↓

Taxonomy

• Kraken2

↓

Abundance

• Bracken

↓

ARG detection

• AMRFinderPlus
• CARD
• Abricate

를 사용했습니다.

특히 ARG가 어떤 균에서 발견되었는지 Long-read 하나에서 직접 연결할 수 있다는 것이 핵심입니다.

이것이 Short-read와 가장 큰 차이입니다.

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평가 방법

이번 논문의 핵심은 Bayesian Latent Class Model(BLCM) 입니다.

보통 진단 성능은

새로운 검사

VS

정답(Gold Standard)

 

을 비교합니다.

하지만 Culture도 완벽하지 않습니다.

그래서 저자들은 Gold Standard를 가정하지 않고

BLCM을 이용해

• Sensitivity
• Specificity

를 계산했습니다.

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주요 결과

① 병원균 검출

Mannheimia haemolytica 2021 신선 샘플에서는

Culture와 거의 동일한 Sensitivity를 보였습니다.

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Pasteurella multocida

흥미롭게도 Metagenomics가 Culture보다 높은 Sensitivity를 보였습니다.

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Histophilus somni

2020에서는 다소 낮았지만 2021에서는 Culture와 거의 비슷했습니다.

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② 항생제 내성 유전자(ARG)

총 127개의 ARG를 검출했습니다.

가장 많이 발견된 것은

• tet(H)
• mphE
• msrE
• EstT

였습니다.

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③ tet(H)는 매우 정확했다

Tet(H)는 Tetracycline 내성과 가장 높은 일치율을 보였습니다.

Sensitivity와 Specificity 모두 높았습니다.

이는 tet(H)가 실제 임상에서 매우 유용한 marker임을 의미합니다.

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Long-read가 가지는 가장 큰 장점

논문에서 여러 번 강조한 부분입니다.

Long-read는

ARG
+
균종

 

을

같은 read에서 확인할 수 있습니다.

즉,

tet(H)
↓
Pasteurella multocida에서 발견

 

처럼

어느 균이 내성 유전자를 갖고 있는지를 직접 연결할 수 있습니다.

Short-read에서는 이러한 연결을 위해 assembly와 많은 계산이 필요하지만, Long-read에서는 개별 read 수준에서 확인할 수 있다는 것이 큰 장점입니다.

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연구의 한계

저자들은 몇 가지 한계도 제시했습니다.

• Bacterial enrichment가 필요함
• Frozen sample에서는 성능이 감소
• 일부 ARG는 표본 수가 적음
• 아직 모든 내성 기전이 알려진 것은 아님

하지만 전반적으로 Metagenomics는 Culture를 상당 부분 대체할 가능성을 보여주었습니다.

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결론

이번 연구는 Oxford Nanopore Long-read metagenomics가 병원균 검출과 항생제 내성 유전자(ARG) 검출을 하나의 분석으로 수행하면서도, 기존 Culture 및 AST와 비교해 높은 특이도와 경쟁력 있는 민감도를 보여줄 수 있음을 입증한 대규모 연구입니다.

특히 Long-read의 강점인 병원균과 ARG를 동일한 read에서 직접 연결(linkage)할 수 있는 능력은 기존 Short-read 기반 메타지노믹스보다 임상적으로 훨씬 큰 장점을 제공합니다. 향후 ARG 데이터베이스와 분석 파이프라인이 지속적으로 발전한다면, Nanopore 기반 metagenomics는 감염 진단과 항생제 내성 감시 분야에서 더욱 중요한 역할을 할 것으로 기대됩니다.

https://doi.org/10.3390/antibiotics14111114