[삼성서울병원-장자현 교수님] 한국에서 또 하나의 흔한 유전성 운동실조증: SCA36

Another common genetic ataxia in South Korea: Spinocerebellar ataxia 36

 

1. 연구 배경

 

Spinocerebellar ataxia(SCA)는 진행성 소뇌 운동실조를 특징으로 하는 상염색체 우성 유전 신경퇴행성 질환입니다. 현재까지 50종 이상의 SCA 아형이 보고되었으며, 이 중 상당수는 반복서열 확장(repeat expansion)에 의해 발생합니다. 한국의 임상 진단 환경에서는 일반적으로 SCA1, 2, 3, 6, 7, 8, 17에 대한 검사에 집중되어 왔습니다. 이로 인해 상대적으로 드물다고 알려진 SCA10, 12, 31, 36과 같은 아형은 실제 빈도에 비해 과소진단되었을 가능성이 있습니다.

 

특히 SCA36은 NOP56 유전자 내 GGCCTG hexanucleotide repeat 확장이 원인으로, 반복 길이가 매우 길어 기존 PCR 기반 검사로는 정확한 크기 측정이 어렵습니다. 전통적으로 Southern blot이 표준 진단 방법으로 사용되어 왔으나, 임상 검사실에서 적용하기에는 시간과 비용, 방사선 사용 등의 한계가 있습니다.

 

본 연구는 이러한 문제를 해결하기 위해 repeat-primed PCR과 Oxford Nanopore 기반 long-read sequencing(LRS)을 활용하여, 한국인 운동실조 환자에서 SCA36의 실제 빈도와 임상적 특징을 체계적으로 분석하는 것을 목표로 하였습니다.

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2. 연구 대상

 

본 연구는 두 개의 환자 코호트를 대상으로 수행되었습니다.

Cohort 1: 원인이 밝혀지지 않은 운동실조 환자군

• 삼성서울병원 및 서울대학교병원 신경과 내원 환자
• SCA1, 2, 3, 6, 7, 8, 17 및 DRPLA 검사에서 모두 음성
• 총 78명, 67가족으로 구성됨

Cohort 2: 무작위 운동실조 환자군

• 2011년부터 2022년까지 유전자 검사 의뢰 환자
• 특정 SCA 아형을 선별하지 않은 실제 임상 환경 반영
• 총 99명으로 구성됨

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3. 실험 방법 (Methods)

 

3-1. PCR 기반 스크리닝 전략

SCA10, 12, 31, 36은 각각 반복 구조와 병적 반복 범위가 다르기 때문에, 아형별로 다른 진단 전략을 적용하였습니다.

• Amplicon Length PCR(AL-PCR)을 통해 정상 범위 반복을 확인하였습니다.
• AL-PCR에서 동형접합이 확인된 경우, Repeat-Primed PCR(RP-PCR)을 추가로 수행하였습니다.
• RP-PCR에서 반복 확장이 존재할 경우 saw-tooth pattern이 관찰됩니다.

SCA36의 경우, RP-PCR에서 saw-tooth pattern만으로는 병적 반복과 의미 불명 반복을 구분할 수 없기 때문에 추가 분석이 필요합니다. SCA31은 (TGGAA)n 반복 삽입이 특징이므로, PCR 증폭 후 HaeIII restriction enzyme digestion을 통해 삽입 여부를 선별하였습니다.

 

3-2. Long-read sequencing을 이용한 반복 길이 확정

 

SCA36에서 반복 확장이 의심되는 환자에 대해 Oxford Nanopore 기반 long-read sequencing을 수행하였습니다.

• CRISPR-Cas9 시스템을 이용해 NOP56 반복 부위를 포함한 약 4.2 kb 영역을 타겟 농축하였습니다.
• ONT ligation kit(R9.4, SQK-LSK109/110)를 사용하여 라이브러리를 제작하였습니다.
• MinION flowcell을 이용해 충분한 커버리지가 확보될 때까지 시퀀싱을 진행하였습니다.

Basecalling은 Dorado(dna_r9.4.1_e8_sup@v3.6 모델)를 사용하였으며, 반복서열 분석을 위해 chunk size를 크게 설정하였습니다. 정렬은 GRCh38 reference genome을 기준으로 수행하였습니다. 반복 횟수 계산에는 RepeatHMM을 사용하였으며, 개별 read 단위 반복 수를 로그 변환한 뒤 two-Gaussian mixture model을 적용하여 두 allele을 분리하였습니다. 각 클러스터의 중앙값을 최종 반복 횟수로 정의하였습니다.

A: Repeat-primed PCR(RP-PCR)에서 음성 결과를 보인 예입니다. B: RP-PCR에서 확장 반복 존재를 시사하는 전형적인 saw-tooth pattern입니다. C: Oxford Nanopore Technologies 기반 long-read sequencing(LRS)에서 음성 결과를 보인 예입니다. D: LRS에서 NOP56 유전자 intron 내 대규모 반복 삽입이 확인된 결과입니다.

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4. 연구 결과

4-1. SCA36의 빈도

• Cohort 1(미진단 운동실조 환자군):
  전체 67가족 중 8가족에서 SCA36이 확인되어, 11.9%의 빈도를 보였습니다.
• Cohort 2(무작위 환자군):
  전체 99명 중 1명에서 SCA36이 확인되어, 1.0%의 빈도를 보였습니다.

SCA10, 12, 31은 두 코호트 모두에서 발견되지 않았습니다. 이는 기존 진단 체계에서 제외되었던 SCA36이 한국에서는 결코 드물지 않다는 점을 시사합니다.

 

각 그림의 이니셜은 환자 식별 번호를 나타냅니다. Read 단위 반복 횟수는 로그 변환 후 두 개의 Gaussian 혼합 모델로 분석하였으며, 각 클러스터의 중앙값을 allele 반복 길이로 정의하였습니다. 표시된 샘플들은 RP-PCR에서 확장이 의심되어 long-read sequencing을 수행한 사례입니다.

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4-2. 임상적 특징

 

한국인 SCA36 환자의 임상 양상은 기존 해외 보고와 전반적으로 유사하였습니다.
다만, 한 가지 두드러진 차이점이 관찰되었습니다.

• Hyperreflexia(과다반사)가 모든 환자(100%)에서 관찰되었습니다.

이는 전 세계 SCA36 환자군에서 보고된 빈도(약 56%)보다 유의하게 높은 수치이며, 일본 및 중국 환자군과 유사한 양상으로, 동아시아 지역에서의 founder effect 가능성을 시사합니다.

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5. 연구의 의의

 

본 연구는 Southern blot 없이도 Oxford Nanopore long-read sequencing과 CRISPR 기반 타겟 농축만으로 반복 확장 질환인 SCA36을 임상적으로 진단할 수 있음을 입증하였습니다. 특히 반복 길이가 불명확하거나 PCR 결과 해석이 어려운 경우, long-read sequencing은 기존 진단 방법의 한계를 극복할 수 있는 실질적인 대안임을 보여줍니다.

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6. 결론

 

본 연구 결과는 한국에서 SCA36이 과소진단되어 왔음을 시사하며, long-read sequencing을 진단 프로토콜에 포함할 경우 진단 정확도를 크게 향상시킬 수 있음을 보여줍니다. SCA36은 드문 질환이 아니라, 기존 기술로는 충분히 드러나지 않았던 질환이었으며, 그 실체를 밝히는 데 long-read sequencing이 핵심적인 역할을 수행하였습니다.

https://www.nature.com/articles/s41431-024-01783-9