[Virus] CoNS-seq — 저농도 바이러스 고감도 검출을 위한 나노포어 기반 파이프라인

A sensitive sample preparation pipeline for adventitious virus detection using Oxford Nanopore sequencing

Oxford Nanopore 시퀀싱 기반 이종 바이러스 검출을 위한 고감도 샘플 전처리 파이프라인

 

최근 세포 및 유전자 치료제 제조 환경에서 바이러스 오염(adventitious virus)에 대한 신속하고 민감한 검출이 중요해지고 있습니다.

 

특히 자가 세포 치료제의 경우, 살아있는 세포 자체가 약물이기 때문에 멸균 처리가 불가능하고, 제조 공정이 복잡한 무균 작업으로 이루어져 있어 오염 리스크가 상대적으로 높습니다.

 

기존의 바이러스 검출법인 in vitro / in vivo compendial assay는 최대 28일 이상의 시간이 소요되며, 자가 세포 치료제의 짧은 유통기한과 빠른 투여 필요성에 부합하지 않습니다.

 

이에 따라, 빠르고 민감한 검출이 가능한 시퀀싱 기반 대체 기술이 요구되고 있으며, 특히 고처리량 시퀀싱(HTS)은 새로운 표준으로 주목받고 있습니다.

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Oxford Nanopore 시퀀싱 기반 CoNS-seq 파이프라인

 

이번 연구에서는 Oxford Nanopore Technologies의 롱리드 시퀀싱 플랫폼을 기반으로, 농축(concentration), 뉴클레이스 처리(nuclease treatment), SISPA 비가설적 PCR 증폭을 포함한 새로운 샘플 전처리 방법인 CoNS-seq 파이프라인을 개발했습니다.

 

이 파이프라인은 다음과 같은 강점을 가집니다:

• 연구팀은 바이러스 농축, 뉴클레아제 처리, 시퀀스 비의존적 단일 프라이머 증폭(SISPA) 단계를 조합한 CoNS-seq 샘플 준비법을 제안했습니다. (숙주 유래 핵산 제거 → 배경 잡음 감소)
• 기존 샘플 준비법 대비 최대 1,000배 이상 민감도가 향상되어, 세포당 단 0.001개 바이러스 게놈 수준까지 검출 가능했습니다. (낮은 농도의 바이러스 → 검출 민감도 향상)
• 숙주 DNA가 많은 환경에서도 바이러스 리드가 최대 1,420배까지 농축되어, 높은 배경 잡음에도 불구하고 정확한 검출이 가능했습니다. (미지 바이러스 포함 → 비표적 검출 가능)
• Oxford Nanopore의 장점인 롱리드 시퀀싱은 전체 바이러스 게놈을 한 번에 커버할 수 있어, 빠르고 정확한 식별을 가능하게 했습니다. (실시간 분석 → 결과 도출 시간 단축)

“Short-read 시퀀싱과 달리, Oxford Nanopore는 실시간 basecalling 및 정렬 기능이 있어 전체 분석 시간을 단축시킬 수 있습니다.”— Tsinda & Swofford et al. 2025

 

실제로 CoNS-seq는 숏리드 시퀀싱으로 검출이 어려웠던 바이러스(MVM, PCV1 등)를 더 낮은 농도에서 안정적으로 검출할 수 있었고, 7일 이내에 결과 도출이 가능하여 기존 방식보다 23일 빠른 출하 결정이 가능합니다.

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실험 방법: CoNS-seq 샘플 전처리 파이프라인

 

이번 연구에서는 Oxford Nanopore 시퀀싱에서 희박한 바이러스 오염원을 민감하게 검출하기 위한 전용 전처리 파이프라인(CoNS-seq)을 개발했습니다. 기존 방식으로는 숙주 핵산이 너무 많아 바이러스 시퀀스를 읽기 어렵다는 한계를 극복하기 위해 다음과 같은 3단계 접근법을 사용했습니다:

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1. 바이러스 입자 농축 (Concentration using Ultrafiltration)

• 샘플량: 15 mL의 대용량 샘플을 사용
• 사용 장비: 3nm 공극(pore size)의 초여과 필터 (ultrafilter)
• 목적: 바이러스 입자를 선택적으로 농축하여, 희박한 오염물도 포착 가능하게 함
• 참고: PCV1(17nm 캡시드 크기)처럼 작은 바이러스도 효과적으로 농축됨

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2. 뉴클레이스 처리 (Host DNA/RNA 제거)

• 과정: 필터링된 샘플에 뉴클레이스(nuclease)를 처리
• 효과: 세포 유래 잔여 DNA 및 RNA 제거
• 의의: 전체 리드 수에서 숙주 유래 배경 신호를 감소시켜 바이러스 검출 민감도 향상
• 한계: 바이러스 핵산까지 일부 손실 가능 → 다음 단계로 보완

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3. SISPA (Sequence-Independent Single Primer Amplification)

• 기술: 비표적(single-primer), 무작위 프라이머 기반 증폭 방식
• 목적: 남아 있는 모든 유전물질을 무작위로 증폭하여,
  → 특정 바이러스 유전체 여부에 관계없이 검출 가능
• 장점:
  • 기존 PCR과 달리 타깃 정보 없이도 증폭 가능
  • 다양한 바이러스 종류(예: ssDNA, dsDNA, ssRNA 등)에 폭넓게 적용
• 보완사항: 일부 coverage bias 존재 (예: GC-rich 구간),
  하지만 롱리드 시퀀싱의 read 길이 장점으로 보정 가능

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4. Oxford Nanopore 시퀀싱 (MinION/GridION)

• 플랫폼: GridION X5 (5 flow cell 병렬 구동)
• 시퀀싱 시간: 4~12시간
• Basecalling: 실시간 basecalling & alignment
• Read 수: 평균 약 2.2백만 read/sample (짧은 시간 대비 고효율)

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5. 분석 및 바이러스 탐지

• 비교 기준: 기존 숏리드 방식 대비
• 결과:
  • MVM: 0.001 vg/cell 수준에서도 안정적 검출 (기존 숏리드는 0.01 vg/cell에서 실패)
  • PCV1: 1 vg/cell 스파이크 시 7,423 read 검출 (기존 방식 195 read 대비 38배↑)
  • FeLV: 기존 숏리드와 동일한 0.001 vg/cell 검출 가능

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단일 파이프라인으로 적용 가능한 다양한 사례

바이러스	기존 숏리드 검출 한계	CoNS-seq 검출 성능	리드 수 향상
MVM	0.01 vg/cell 미검출	0.001 vg/cell 검출	안정적 검출
PCV1	1 vg/cell, 195 reads	1 vg/cell, 7,423 reads	약 38배
FeLV	0.001 vg/cell	동일 수준 검출	동일 수준

 

CoNS-seq는 DNA 바이러스에 비해 RNA 바이러스 검출 성능이 낮게 나타날 수 있음도 함께 보고되었으며, 향후 역전사 효소나 조건 최적화를 통해 RNA 기반 바이러스 탐지 민감도 향상이 기대됩니다.

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규제기관 가이드라인 부합 및 향후 방향

• WHO 바이러스 참조 패널 일부 바이러스를 사용하여 민감도 및 특이도 검증
• Eur. Ph. 2.6.41 draft chapter와 부합하도록 3개의 반복 실험을 통해 LOD 확인
• 기존 IVV 시험법 대비 빠르고 신뢰도 높은 핵산 기반 분석법으로의 대체 가능성 제시
• 나아가 미생물 오염 감지 및 AMR 분석에도 응용 가능성

예: SISPA 기반 분석을 통해 Acinetobacter baumannii 75개 균주를 계통학적으로 분류 가능

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