나노포어 어플리케이션/Poster
롱리드 기반 싱글셀 및 공간 유전체 분석: 아이소폼 수준까지의 정밀 해석
youngmun
2025. 4. 22. 14:49
Alternative transcript isoform detection with single cell and spatial resolution
ONT PromethION 플랫폼을 활용한 싱글셀 및 Visium 공간 전사체 분석을 통해, 기존의 쇼트리드 기반 분석법보다 훨씬 정밀하게 아이소폼(isoform) 수준에서 유전자 발현을 분해할 수 있음을 보여준 연구 결과를 소개합니다.
연구 목적
- 기존 short-read 기반 single cell 분석의 한계
→ 유전자 수준까지만 해석 가능, 아이소폼 구분 어려움 - 이번 연구는 Oxford Nanopore의 롱리드 시퀀싱(PromethION) 기술을 사용하여 세포별 및 공간별로 대체 전사체 아이소폼을 정확히 식별할 수 있음을 입증
실험 구성 요약
1. 샘플 종류
- PBMC (말초 혈액 단핵세포)
- 폐암 DTC (dissociated tumor cells)
- 생쥐 뇌 조직 (Visium spatial)
2. 실험 키트 및 시퀀싱 플랫폼
| 구분 | 사용 기술 |
| 싱글셀 | Chromium 3′, 5′ (10x Genomics) |
| 공간 유전체 | Visium Spatial Gene Expression |
| 쇼트리드 시퀀싱 | Illumina NovaSeq |
| 롱리드 시퀀싱 | ONT PromethION (Dorado basecalling 사용) |
분석 방법
라이브러리 및 시퀀싱
- 10x Genomics 프로토콜에 따라 full-length cDNA 생성
- HAC/SUP basecalling 모델 적용
- Illumina와 ONT 모두 동일 샘플에서 시퀀싱 진행
Cell calling 및 클러스터링
- Cell Ranger (Illumina)
- Sockeye (ONT 전용)
→ 바코드 및 UMI만으로 ONT 단독 분석 가능
Isoform 정량 분석
- FLAMES 파이프라인 사용
→ full-length isoform 수준에서 발현량 및 클러스터 정리
시각화 및 주석
- Seurat (R 패키지): UMAP 기반 클러스터링
- Azimuth: 세포 타입 주석
주요 결과 요약
1. ONT만으로도 Cell Calling 및 Clustering 성공
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2. Isoform 기반 클러스터링에서 더 세분화된 세포 분류 가능
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3. Visium 공간 분석에서도 isoform 기반 구분 가능
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결론
- ONT 롱리드 시퀀싱은 쇼트리드 기반 방식보다 훨씬 풍부한 유전자 해석 정보를 제공
- full-length 기반으로 아이소폼 수준까지 구분 가능
- 싱글셀 분석뿐 아니라, 공간 유전체 분석에서도 롱리드만의 강력한 해석력 확인
단순한 유전자 발현 수준을 넘어, 정밀한 대체 스플라이싱 및 구조적 변이 해석이 가능
→ 질병 진단, 면역 세포 분류, 뇌 영역 특이적 유전자 분석에 탁월한 응용 가능성
사용된 툴 정리
| 분석 단계 | 사용 툴 |
| Cell calling | Cell Ranger (Illumina), Sockeye (ONT) |
| Isoform 분석 | FLAMES |
| 클러스터링/주석 | Seurat, Azimuth |
| 시각화 | UMAP, Violin plot |
| 시퀀싱 | PromethION (ONT), NovaSeq (Illumina) |
참고자료:
https://nanoporetech.com/resource-centre/alternative-transcript-isoform-detection-with-single-cell-and-spatial-resolution