SQK-RPB114.24 키트를 활용한 박테리아, 곰팡이, 바이러스 병원체 감시용 초고속 메타유전체 시퀀싱
Rapid metagenomic sequencing for surveillance of bacterial, fungal and viral pathogens using SQK-RPB114.24
이번에 출시된 end-to-end rapid metagenomic sequencing workflow는 박테리아, 진균, 바이러스 병원체를 빠르게 식별할 수 있도록 설계된 솔루션입니다. SQK-RPB114.24 키트를 기반으로 하며, 호흡기 샘플을 포함한 다양한 시료에 적용 가능합니다.
해당 워크플로우는 샘플 전처리부터 분석까지 전 과정을 end-to-end로 구성하고 있으며, 바이러스, 박테리아, 진균 등 다양한 병원체에 대한 신속하고 직관적인 메타게놈 분석을 제공합니다.
자세한 프로토콜은 아래 링크에서 확인하실 수 있습니다: 링크
샘플 및 라이브러리 준비 방법
이 프로토콜은 핵산 추출 후, 시료 내 존재하는 모든 미생물의 유전체를 포괄적으로 분석하여
어떤 병원체가 포함되어 있는지를 파악하는 agnostic metagenomics 방식입니다.
시료 유형에 따라 다음 두 가지 방식으로 샘플을 준비합니다:
- Bacterial/Fungal sample
- 숙주 제거(Saponin 처리) → DNA 추출 → Tagmentation 및 PCR - Viral sample
- background 제거 → 핵산 추출 → 역전사(SMART-9N) → PCR
→ Josh Quick와 Ingra M. Clare의 방법 기반
이후, 두 시료를 풀링하여 어댑터를 부착한 후 시퀀싱을 진행하게 됩니다.
해당 방법은 최대 24개의 샘플을 바코딩하여 한 번에 실험할 수 있습니다.
분석 및 결과 확인
시퀀싱 후에는 Epi2me Labs의 wf-metagenomics 파이프라인을 통해 병원체 탐지 결과 리포트를 자동으로 확인하실 수 있습니다.
- 미생물 군집의 상대적 풍부도
- 항생제 내성 유전자(AMR)의 존재 여부
- 메타게놈 조립, 계통분석 등 심화 분석 가능
https://nanoporetech.com/document/rapid-sequencing-metagenomics-sqk-rpb114-24
Rapid metagenomic sequencing for surveillance of bacterial, fungal and viral pathogens using SQK-RPB114.24 know-how document
https://nanoporetech.com/document/requirements/rapid-metagenomic-sequencing-for-surveillance-of-bacterial-fungal-and-viral-pathogens-using-sqk-rpb114-24-know-how-document
Inclusivity Panel Test
- Zeptometrix사의 RP2.1 호흡기 패널을 사용해 바이러스, 세균, 비정형 세균 검출 확인
- Control Panel 1, 2를 각각 사용해, 총 20종 이상의 병원체가 검출됨
Input Tritration (검출 한계 측정)
- 아데노바이러스, 인플루엔자: 10³~10⁴ copies/mL
- 그람음성균(E. coli), 그람양성균(S. aureus): 약 10³ cfu/mL
- Candida albicans: 10² cfu/mL
→ 낮은 농도의 병원체도 검출 가능함을 입증
멀티플렉싱 및 시퀀싱 결과
최대 24개 샘플을 한 번에 시퀀싱 가능 (단, dual-arm 실행 시 11 샘플 + NTC)
24시간 및 72시간 런 비교 시 출력량은 두 배로 증가하지만, 샘플 수가 많을수록 개별 커버리지는 낮아짐
→ 분석 목적에 따라 런타임 조절 필요
샘플 정규화의 중요성 (Sample Normalisation)
- 정규화를 하지 않으면 샘플 간 산출량 차이가 심함
(예: 0.5Gb vs 7.1Gb → 13배 차이 발생) - 정규화 시, 각 바코드 간 데이터 편차가 줄어들어 실험 재현성과 신뢰성 향상
호스트 제거의 중요성 (Host Depletion)
- 객담 샘플에서 사람 유전체가 병원체보다 약 10⁵배 더 많음
- Host depletion을 하지 않으면 사람 리드가 전체의 96% 이상 차지
→ 병원체 검출 어려움 - 제거 후:
- 세균 arm: 병원체 리드 40.85배 증가
- 바이러스 arm: 9.16배 증가
- 전체적으로 17.67배 향상
- Zeptometrix 컨트롤 2에서 host를 제거하지 않으면
→ B. pertussis, B. parapertussis가 아예 검출되지 않음
결론 요약
- SQK-RPB114.24 키트는 세균, 진균, 바이러스 병원체를 빠르고 정확하게 동시에 검출할 수 있는 강력한 메타게노믹 도구입니다.
- 샘플 정규화 및 host 제거가 실험 성공의 핵심 포인트이며,
- 다양한 병원체를 저농도에서도 검출 가능하다는 것이 입증되었습니다.
https://nanoporetech.com/document/requirements/rapid-metagenomic-sequencing-for-surveillance-of-bacterial-fungal-and-viral-pathogens-using-sqk-rpb114-24-know-how-document